Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа PARP1

Номер контракта: 14.604.21.0063

Руководитель: Студитский Василий Михайлович

Должность руководителя: Ведущий научный сотрудник

Докладчик: Малюченко Наталия Валериевна, Доцент

Организация: федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
parp1, ингибиторы parp1, противоопухолевые лекарства, транскрипция in vitro

Цель проекта:
1.1. Разработка новых методических подходов для исследований транскрипционного фактора PARP1, являющегося мишенью действия противоопухолевых препаратов. 1.2. Предоставление научно-исследовательским организациям новых и эффективных методов и средств проведения исследований в области изучения механизмов транскрипции и, в частности, транскрипционных факторов, задействованных в механизмах канцерогенеза. 1.3. Получение значимых научных результатов по механизму действия PARP1 при транскрипции хроматина, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции (функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов, ингибирующих активность PARP1). 1.4. Создание обобщенной модели действия PARP1 методами компьютерного моделирования на основе полученных экспериментальных данных и на основе систематизации научно-технической литературы. 1.5. Получение макета функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ должны быть получены следующие научно-технические результаты:
2.1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
2.2. Лабораторный технологический регламент получения функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1.
2.3. Экспериментальные образцы функциональной системы скрининга противоопухоле-вых препаратов на основе анализа PARP1 (далее - ЭО):
 ЭО группы №1 – минимальная модельная высокоочищенная мононуклеосомная система для транскрипции in vitro с целью функционального анализа действия PARP1, включающая лигированный комплекс из отдельно реконструированных нуклеосом на матричной ДНК с отдельно собранным транскрипционным ком-плексом на основе РНК-полимеразы (буфер для проведения транскрипции, со-держащий белковый фактор PARP1 и НАД+, изотопную метку. Буфер для детекции продуктов, соответствующий ПААГ в денатурирующих и нативных услови-ях);
 ЭО группы №2 – модификация ЭО №1 для детекции продуктов футпринтингом гидроксильными радикалами или ДНКазой 1 путем внесения в буфер соответствующих реагентов;
 ЭО группы №3 – модификация ЭО №1 для проведения кинетических измерений с использованием системы быстрого смешивания реагентов KinTek;
 ЭО группы №4 минимальная модельная высокоочищенная мононуклеосомная система для транскрипции in vitro с целью функционального анализа действия PARP1, включающая лигированный комплекс из отдельно реконструированных нуклеосом на модифицированной матричной ДНК с отдельно собранным транскрипционным комплексом на основе РНК-полимеразы. Буфер для проведения транскрипции. Метод детекции ЭО путем осуществления Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET);
 ЭО группы №5 модификация ЭО №1-4 путем введения в буфер транскрипции различных агентов, модулирующих активность PARP1.
2.4. Методика контроля качества экспериментальных образцов функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1.
2.5. База данных по ингибиторам PARP1.
2.6. Компьютерная модель поверхностей нуклеиновых кислот и белков, задействованных во взаимодействии с PARP1.
2.7. Макет функциональной системы (улучшенный экспериментальный образец с опти-мальными характеристиками) функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1.
2.8. Экспериментальная система, имитирующая более сложную хроматиновую структуру.
2.9. Инструкция по использованию функциональной системы.
2.10. Проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Широкомасштабный скрининг в функциональной PARP1- системе с целью обнаружения перспективных противоопухолевых соединений».
2.11. Технико-экономическое обоснование (ТЭО) разработки с учетом технологических возможностей индустриального партнера.
2.12. Рекомендации и предложения по использованию результатов поисковой ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечный продукт - функциональная система скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа фактора PARP1. Подобная система необходима для поиска новых препаратов, отличающихся от существующих ингибиторов PARР1. Подавляющее большинство существующих ингибиторов PARP1, ориентированы на каталитический домен данного белка и ведут себя как конкурентные ингибиторы по отношению к НАД+. Именно это является уязвимым местом всех ингибиторов PARP1. Известно, что НАД+ взаимодействует со многими клеточными ферментами и поэтому соединения, направленные на ингибирование связывания НАД+, имеют довольно низкую специфичность к PARP1, а также перекрывают другие ферментативные пути в клетке с участием НАД+. Не решен также вопрос о безопасности длительного применения существующих ингибиторов PARP1. Поскольку опухолевые клетки обладают способностью быстро развивать устойчивость к препаратам при длительной терапии единственным препаратом. Все это в целом, обуславливает актуальность разработки новых подходов и тест-систем для поиска некаталитических ингибиторов PARP1. Данный проект направлен на разработку системы, позволяющей обнаруживать не только каталитические ингибиторы PARP1, но и соединения, направленные на другие функционально активные домены PARP1. В настоящее время, все существующие системы направлены на поиск ингибиторов каталитической активности фермента PARP1. В проведенных двух патентных исследованиях не обнаружено действующих патентных документов, в которых описывается подход по использованию нуклеосомных систем транскрипции in vitro для поиска ингибиторов PARP1. Это определяет новизну проекта и новизну полученных экспериментальных данных.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Выполнение проекта создаст необходимый научный и технологический задел для получения системы поиска и функциональной проверки новых противоопухолевых лекарственных препаратов, направленных на PARP1. Создаваемая в проекте система является миниатюрной функциональной системой, воспроизводящей клеточный процесс транскрипции. Использование данной системы позволяет существенно сократить стадию «отсева» нефункционально активных молекул, которую традиционно проводят на клеточных культурах. Что в значительной степени удешевляет и убыстряет процесс поиска новых лекарственных соединений. Особо стоит отметить, что систему можно функционализировать введением молекулярных мишеней и отбирать в ней соединения, имеющие четкую направленность на мишень. В данном проекте система будет функционализирована PARP1 как перспективной противоопухолевой мишенью для действия противоопухолевых лекарств. Кроме того, разработка такой системы перспективна не только для поиска противо-опухолевых препаратов, но и для получения лекарств для терапии сердечно-сосудистых, воспалительных, нейродегенеративных заболеваний, а также влияющих на процесс старения клетки. В целом, проводимые исследования необходимы для дальнейшего развития фармацевтической и биотехнологической промышленности в России, а также для разработки новых методов и подходов в терапии социально значимых заболеваний

Текущие результаты проекта:
В 2015 году получены следующие результаты. Осуществлен подбор оптимального функциональных транскрипционных тестов для проверки активности PARP1 на основе флуоресцентного анализа. Выбрана техника FRET, поскольку данный метод позволяет изучать конформационные переходы, происходящие внутри сложных макромолекулярных комплексов. Разработаны флуоресцентные методы идентификации и определения структур ключевых интермедиатов, формирующихся в присутствии PARP1: методами FRET. Проведен дизайн и созданы матрицы функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа. Создано 4 вида нуклеосомных матриц с разным расположением меток: серединным, проксимальным, дистальным и на вненуклеосомной части ДНК. Cоздана база данных, содержащей информацию об ингибиторах PARP1. Проведено компьютерное моделирование молекулярных поверхностей, задействованных во взаимодействии с PARP1. Обнаружен перспективный функциональный интерфейс для поиска новых ингибиторов PARP1 - домен BRCT. Данный участок обеспечивает взаимодействие белка PARP1 с различными партнерскими белками, при этом BRCT домен отличается от интерфейса, к которому направлены классические ингибиторы PARP. Разработан лабораторный технологический регламент получения функциональной системы скрининга противоопухолевых препаратов на основе анализа белкового фактора PARP1. Были получены экспериментальные образцы ЭО№№1-4. ЭО группы 1 представляют собой бесклеточную систему транскрипции in vivo, в которой присутствует фактор PARP1. Анализ в данной системе проводится с помощью биохимического анализа продуктов транскрипции ( меченных изотопной меткой) в ПААГ в денатурирующих условиях. ЭО группы 2 представляют собой бесклеточную систему транскрипции in vivo, в которой присутствует фактор PARP1. Анализ в данной системе проводится с помощью биохимического анализа методом ДНКаза1 футпринтинга с последующим ПААГ в денатурирующих условиях. ЭО группы 3 представляют собой бесклеточную систему транскрипции in vivo, в которой присутствует фактор PARP1. В отличие от ЭО№1 и ЭО№2, для проведения кинетических измерений к реакциям при помощи прибора KinTek был добавлен избыток NTP и реакции элонгации были остановлены после 3’’, 10”, 45”, 2’, 5’, 10’. Анализ в данной системе проводится с помощью биохимического анализа продуктов транскрипции ( меченных изотопной меткой) в ПААГ в денатурирующих условиях. Экспериментальные образцы группы 4 представляют собой системы, меченные не изотопной, а флуоресцентной меткой и предназначенные для проведения FRET анализа экспериментальных образцов по исследованию связывания PARP1 с нуклеосомой. Разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов. Разработана методика контроля качества и анализа экспериментальных образцов. Проведены испытания экспериментальных образцов группы 1-4 в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний. По результатам анализа образцы группы 1 и группы 4 выбраны в качестве прототипов для создания функциональной системы скрининга ингибиторов PARP1. На дальнейших этапах будет проведена экспериментальная оценка пригодности данных образцов для анализа действия ингибиторов PARP1. В случае позитивных результатов, будет осуществлена доработка и усовершенствование экспериментальных образцов ЭО№1 и ЭО№4 с целью разработки макета системы скрининга противоопухолевых препаратов ингибиторов PARP1. В 2015 году проведены дополнительных патентных исследований. Задачи дополнительных патентных исследований определены как проведение поиска патентов и заявок по теме способов проверки PARP1 активности и разработки функциональных тест-систем для проверки активности PARP1. Проведены необходимые мероприятия по достижению заданных значений программных индикаторов. В 2015 были опубликованы 3 статьи в отечественных и международных журналах, индексируемых Scopus и Web of science. Результаты проведенной работы представлены индустриальным партнером в виде постеров на 8 мероприятиях по демонстрации и популяризации результатов и достижений науки. В экспериментальных работах используется оборудование центра коллективного пользования МГУ имени М.В. Ломоносова "Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное исследование ", а также три установки зарубежной инфраструктуры. Показатели "Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности исследователей-участников проекта" и "Средний возраст исследователей – участников проекта", «Объем привлеченных внебюджетных средств» превышают запланированные. Ссылка на официальный сайт Получателя субсидии в сети Интернет, где в открытом доступе размещены сведения о ходе выполнения прикладных научных исследований (проекта): http://www.bio.msu.ru/dict/view.php?ID=307