Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии производства синтетической вакцины против гепатита Е

Номер контракта: 14.604.21.0064

Руководитель: Чумаков Алексей Михайлович

Должность: Директор Института

Организация: федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН"
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
гепатит е (ге), вирус гепатита е (вге), вакцина, синтетический пептид, диагностика

Цель проекта:
1. Проект направлен на предотвращение потерь, связанных с заболеванием гепатитом Е (ГЕ), путем разработки технологии производства вакцины против этой инфекции. 2. Цель проекта – создание синтетической вакцины, эффективной против вируса гепатита Е (ВГЕ) человека и синтетической вакцины, эффективной против ВГЕ животных, циркулирующих на территории Российской Федерации. Разработка системы диагностики гепатита Е.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Оригинальная тест-система для выявления вируса гепатита Е методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
2. База данных изолятов вируса гепатита Е, циркулирующих на территории Российской Федерации, содержащая эпидемиологические и генетические характеристики каждого варианта вируса гепатита Е, выявленного в Российской Федерации.
3. Технология экспериментального воспроизведения инфекции, вызываемой вирусом гепатита Е, на приматах и на восприимчивых сельскохозяйственных животных (свиньи и кролики).
4. Оригинальный синтетический пептид, аналогичный естественному антигену вируса гепатита Е.
5. Технология получения, концентрирования и очистки вакцинного препарата, основанного на синтетическом пептиде, аналогичного естественному антигену вируса гепатита Е.
6. Вакцинный препарат против гепатита Е, предназначенный для защиты людей от инфицирования.
7. Вакцинный препарат против гепатита Е, предназначенный для защиты сельскохозяйственных животных (свиней и кроликов) от инфицирования.
8. Сведения об иммуногенности и протективых свойствах вакцинных препаратов против гепатита Е.
9. Нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю вакцины против гепатита Е в двух вариантах – для людей и для ветеринарии.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. В результате выполнения ПНИ созданы тест-система для выявления РНК ВГЕ методом ПЦР и вакцина против ГЕ в двух вариантах - для человека и для животных. Созданная на первом этапе ПНИ тест-системы для выявления вируса гепатита Е методом найдет свое применение в области дифференциальной диагностики, мониторинга и регистрации вирусных гепатитов.
Технология экспериментального моделирования инфекции, вызываемой вирусом гепатита Е, может быть использована для исследований по оценке противовирусной активности различных терапевтических и вакцинных противовирусных препаратов, а также методов вирусной инактивации.
Применение разработанной вакцины против гепатита Е в профилактической медицине позволит предотвратить заражение гепатитом Е для лиц, относящихся к группам риска по данной инфекции - населения регионов России и мира, эндемичных по данной инфекции; лиц, выезжающих в гиперэндемичные регионы; работников свиноферм, мясобоен и очистных сооружений; пожилых лиц и пациентов с иммуносупрессией. Таким образом, предполагаемый охват лиц, нуждающихся в защите с помощью предлагаемой вакцины, крайне велик в связи с актуальной эпидемиологической ситуацией по данной инфекции. Исходя из данных о росте заболеваемости гепатитом Е в других странах Европейского региона, данный вакцинный препарат будет востребован не только в России, но и за рубежом.
2. Впервые в мире создана система экспрессии капсидного белка ВГЕ, основанная на синтетическом гене с оптимизированными для экспрессии в E.coli кодонами. Данный подход обеспечивает получение белка для создания вакцины в растворимой форме, что не было достигнуто другими группами исследователей.
3. Конкурентное преимущество созданной вакцины заключается в том, что она основана на штаммах ВГЕ, циркулирующих на территории РФ, и будет обеспечивать защиту от всех генотипов вируса.
4. Использование при создании вакцины синтетических антигенов ВГЕ позволяет избежать недостатков, характерных для живых вакцин (возврат патогенности, остаточная вирулентность, неполная инактивация и т. п.), такие синтетические вакцины обладают стандартностью, слабой реактогенностью, безопасны. Применение метода оптимизации кодонов в синтетическом гене позволяет получать продуцируемый белок в растворимой форме, что с одной стороны, значительно упрощает и удешевляет производство вакцины, а с другой стороны - позволяет получать белок, максимально приближенный к нативному по своим свойствам.
Применение вакцинного препарата против гепатита Е в сельском хозяйстве позволит снизить циркуляцию вируса гепатита Е среди свиней и свести к минимуму риск алиментарного заражения вирусом гепатита Е.
Таким образом, результаты данной работы позволяет создать систему контроля за гепатитом Е, включающую в себя диагностику данной инфекции, ее моделирование для оценки новых противовирусных препаратов, и специфичную вакцинопрофилактику.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Полученные результаты могут использоваться в практической медицине для предотвращения гепатита Е, а также в ветеринарии для защиты поголовья домашних свиней от инфицирования ВГЕ и ликвидации этого потенциального источника заражения ВГЕ для человека;
2. Применение разработанной вакцины против гепатита Е в профилактической медицине позволит предотвратить заражение гепатитом Е и послужит средством специфической профилактики данной инфекции.
3. Технология получения и экспрессии синтетического гена, разработанная и апробированная в данном проекте для производства вакцины против гепатита Е, может быть использована для получения других противовирусных вакцин.
4. В настоящее время существует единственная вакцина против гепатита Е, лицензированная только на территории Китая и
недоступная для применения в РФ, странах Европы и Северной Америки. Разработанная отечественная вакцина против ГЕ потенциально востребована на международных рынках, как готовый продукт и как технология получения вакцинного препарата.

Текущие результаты проекта:
Создана система экспрессии капсидного белка ВГЕ – на основе вектора pET3a сконструирована плазмида pET-ORF2, несущая фрагмент гена ORF2 вируса. На основе вектора pET3a сконструирована плазмида pET-ORF2. Клонированный в вектор pET3a фрагмент длиной 1719 bp включает ген ORF2, представляющий вторую рамку считывания генома вируса гепатита Е. Для оптимизации гетерологичной экспрессии капсидного белка ORF2 был использован уникальный подход к реконструкции генов, основанный на оптимизации кодонов в синтетическом гене, кодирующем капсидный белок ВГЕ, для экспрессии в клетках Escherichia coli. Данный способ позволяет получать продуцируемый белок в растворимой форме. Вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10).
Трансформацией созданной плазмидой pET-ORF2 был получен штамм PORF2. Отобранный штамм продуцирует 1 мг рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е с 1л культуры. Специфичность продуцируемого белка подтверждена методом вестерн-блота с поликлональными антителами к белку ORF2 вируса гепатита Е. Методом электронной микроскопии показано, что продуцируемый белок при экспрессии в штамме-продуценте PORF2 собирается в вирусоподобные частицы размером около 40 нм, что позволяет ожидать высокую иммуногенность вакцинного препарата.
Для выделения и очистки рекомбинантного капсидного белка ВГЕ разработаны методики автоиндукции, метод лизиса и первичной очистки растворимого рекомбинантного белка, определены характеристики и параметры выделения белка на аффинной среде для IMAC. Разработаны варианты элюции рекомбинантного белка с аффинной среды и методики вторичной очистки белка гель-фильтрацией на нескольких носителях.
Разработаны лабораторные технологические регламенты получения двух вариантов вакцины, предназначенных для человека и для сельскохозяйственных животных. В соответствии с данными регламентами получены экспериментальные образцы двух соответствующих вариантов вакцины.
Отработаны две модели гепатита Е на сельскохозяйственных животных – на свиньях и кроликах. Было установлено, что вирус гепатита Е широко распространен среди этих животных, поэтому для экспериментального воспроизведения инфекции на этих животных необходим предварительный скрининг для выявления инфицированных или перенесших инфекцию животных. Обе экспериментальных модели гепатита Е были валидированы относительно стандартной модели инфекции на мелких приматах (мармозетах обыкновенных). Было показано, что оптимальной является экспериментальная модель ВГЕ-инфекции на свиньях, поскольку выявляемые маркеры гепатита Е (РНК ВГЕ, анти-ВГЕ), сроки и длительность их выявления соответствуют наблюдаемым у приматов при экспериментальной ВГЕ-инфекции. Проведены исследования на мышах иммуногенности вакцины с использованием нескольких композиций адъювантов. С учетом полученных данных разработан план доклинических исследований полученной вакцины.