Разработка конъюгированной вакцины нового поколения для обеспечения высокоэффективной профилактики брюшнотифозной инфекции

вакцина, брюшной тиф, конъюгатная вакцина, гликоконъюгаты, врожденный иммунитет, молекулярные адъюванты, vi-антиген

Задачей проекта является создание брюшнотифозной вакцины нового поколения, обеспечивающей повышение эффективности защиты населения от инфекции Salmonella typhi. Целью проекта является разработка технологии получения вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi и рекомбинантного белкового антигена, эффективно стимулирующего иммунный ответ, в частности, активацию CD4+ Т-лимфоцитов (Т-хелперов), активирующего развитие иммунологической памяти, увеличение титра нейтрализующих антител и индукцию переключения изотипов антител.

Основными планируемыми результатами проекта являются:
- наработка и очистка Vi-антигена из S. typhi, охарактеризованного по пирогенности, физико-химическим параметрам, иммуногенным и протективным свойствам;
- получение продуцентов рекомбинантных белковых антигенов – партнёров для конъюгации;
- наработка и очистка рекомбинантных белковых антигенов-партнёров для конъюгации - CRM197, rEPA, fliC, fliC:pagN, характеристика их пирогенности и физико-химических параметров;
- разработка нового технического принципа создания конъюгированных вакцин на основе рекомбинантных белков - стимуляторов иммунного ответа;
- разработка прототипа композиции конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном – стимулятором иммунного ответа;
- получение экспериментальных образцов конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантными белковыми антигенами - стимуляторами иммунного ответа;
- проведение экспериментальных исследований иммунного ответа, вызванного применением химических конъюгатов различных рекомбинантных белковых антигенов - стимуляторов иммунного ответа - с Vi-антигеном S. typhi;
- проведение лабораторных испытаний протективного эффекта экспериментального образца брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном - оптимальным стимулятором иммунного ответа;
- получение препарата-кандидата конъюгированной брюшнотифозной вакцины;
- разработка нормативно-технической документации (технические условия, лабораторный регламент) на получение лабораторных партий конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном – стимулятором иммунного ответа;
- разработка технических требований для создания нового типа брюшнотифозной вакцины, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном-стимулятором иммунного ответа.

На этапе I выполнения проекта (в 2014 г.) был проведен аналитический обзор информационных источников, обоснование и выбор методов и средств, направления исследований и способов получения вакцинных конъюгатов на основе рекомбинантных белков - стимуляторов иммунного ответа и теоретическое исследование путей создания вакцины, основанной на применении рекомбинантных белков - стимуляторов иммунного ответа (теоретическое обоснование отбора белков- партнёров для создания конъюгированной вакцины, дизайн последовательностей, кодирующих белковые антигены-партнёры для конъюгации с учётом кодонной оптимизации трансляции и обеспечения эффективной технологии очистки рекомбинантного белкового антигена-партнёра).
Было получено 2 серии препарата (5 и 7) Vi-антигена S.typhi массой 100 и 120 мг, соответственно, составлена лабораторная методика наработки и очистки Vi-антигена S.typhi и проведено изучение физико-химических характеристик Vi-антигена S.typhi.
Было проведено экспериментальное исследование иммунологических и протективных свойств Vi-антигена S. typhi при иммунизации животных. Развитие гуморального иммунного ответа после введения мышам 5 и 7 серий Vi-антигена S.typhi в дозе 25 мкг/мышь оценивали по образованию Vi-специфических антителообразующих клеток (АОК) и антител. Пик АОК у иммунных мышей отмечен на 7 сутки и составил 27,4 АОК на 106 клеток. При изучении Vi-специфического иммунного ответа (иммуногенности 5 и 7 серий Vi-антигена S.typhi), было установлено доминирование продукции анти-Vi антител IgG класса, титры которых превышали титры IgM антител. При исследовании протективных свойств наработанных Vi-антигенов S.typhi было установлено, что оба препарата при внутрибрюшинном введении в диапазоне доз 0,00025 – 25 мкг/мышь обеспечивали 100% выживаемость при заражении мышей S.typhi Ту2 № 4446 в количестве 1000 клеток/мышь (80 ЛД50).

В 2015 году в рамках выполнения проекта должны быть достигнуты следующие результаты:
- получение продуцентов, наработка и очистка рекомбинантных белковых антигенов-партнёров для конъюгации - CRM197, rEPA, fliC, fliC:pagN (не менее 95% чистоты по данным электрофореза, не более 10 IU эндотоксина на 1 мг белка), характеристика их пирогенности и физико-химических параметров;
- разработка нового технического принципа создания конъюгированных вакцин на основе рекомбинантных белков - стимуляторов иммунного ответа;
- разработка прототипа композиции конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения, основанной на использовании химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном – стимулятором иммунного ответа (эффективность конъюгации Vi-антигена S. typhi с рекомбинантным белковым антигеном-стимулятором иммунного ответа должна составлять не менее 50%);
- получение экспериментальных образцов конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе химического конъюгата Vi-антигена S. typhi с рекомбинантными белковыми антигенами - стимуляторами иммунного ответа (композиция конъюгированной брюшнотифозной вакцины должна быть нетоксична и апирогенна, суммарный подъём температуры тела кроликов не должен превышать 1,4 С).

Преимущества разрабатываемой новой отечественной брюшнотифозной вакцины заключаются в увеличении продолжительности напряжённого иммунитета, возможности индукции иммунитета у детей от 2 лет, формировании иммунитета повышенной длительности и напряжённости по сравнению с иммунизацией полисахаридной вакциной. Cоздание конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения позволит существенно повысить эффективность защиты населения в условиях увеличивающейся опасности инфекции S. typhi, связанной с интенсивными миграционными потоками и развитием антибиотикоустойчивых форм патогена.
Разработка конъюгированной вакцины нового поколения позволит не только повысить эффективность профилактики брюшного тифа, но и создаст предпосылки для создания высокоэффективных конъюгированных вакцин для профилактики других патогенов. Технология создания конъюгированных вакцин, которая будет разработана в рамках данного ПНИ, обеспечит задел для разработки широкой номенклатуры отечественных конъюгированных вакцин для профилактики опасных и социально значимых инфекций. Препарат, который планируется создать на основе коммерческой вакцины «Вианвак», экспортируемой за рубеж, будет обладать значительным экспортным потенциалом.

В ходе выполнения проекта проводится получение следующей инновационной научно-технической продукции:
- технологии выделения и очистки Vi-антигена в форме, пригодной для создания химических конъюгатов с белковыми молекулами;
- штаммов-продуцентов и технологии получения рекомбинантных белковых антигенов-партнёров, избранных на основе имеющейся информации об эффективности и механизме действия различных конъюгированных вакцин;
- методологии оптимальной химической конъюгации Vi-антигена и белкового носителя, обеспечивающей максимальную иммуногенность продукта;
- различных прототипов конъюгатной брюшнотифозной вакцины, состоящей из химически сшитого Vi-антигена S. typhi и белкового партнёра, который представляет собой рекомбинантный высокоэффективный индуктор иммунного ответа при бактериальной инфекции;
- эффективной вакцинной композиции, отобранной на основании сравнительных исследований иммуногенности нескольких различных комбинаций антиген-индуктор.
Конечным результатом проекта является получение прототипа конъюгированной вакцины, вызывающей высокий протективный эффект, выраженный, в первую очередь, в титре антиген-специфических IgG, превосходящем титр, наблюдающийся при применении неконъюгированной полисахаридной вакцины. Разработанный прототип может быть использован для создания фармацевтического препарата брюшнотифозной вакцины, обеспечивающего длительный протективный иммунитет у взрослых и детей от 2 лет.
Материалы, методы и подходы, разработанные в рамках данного проекта, могут быть использованы в создании других прототипов конъюгированных вакцин, предназначенных для профилактики бактериальных инфекций. Результаты сравнения протективного эффекта конъюгатов Vi-антигена с различными белковыми партнёрами позволят получить новую фундаментальную информацию о развитии протективного иммунитета к возбудителю брюшного тифа.
В мире проводится разработка нескольких препаратов конъюгированных брюшнотифозных вакцин. В частности, на протяжении ряда последних лет конъюгированная вакцина на основе Vi-антигена и белкового партнёра разрабатывается в Индии, однако, несмотря на положительные результаты ряда испытаний, иммунный ответ на конъюгаты с классическими белками-носителями может варьировать в значительных пределах, что неприемлемо для вакцины широкого применения. Поэтому в ряде стран, в том числе несколькими группами в США с участием индийских исследователей, ведётся разработка нового поколения вакцины, учитывающего недостатки предыдущих вариантов, в частности, и с использованием новых белковых партнёров для конъюгации. Разрабатываемая авторами проекта технология в целом является исследованием в близком направлении и находится на мировом уровне.

Разработка и испытания брюшнотифозной конъюгированной вакцины являются первым элементом отечественной технологической платформы по созданию конъюгированных вакцин для профилактики различных бактериальных инфекций. В мире существует целый ряд конъюгированных вакцин, не производящихся в РФ и используемых для профилактики таких широко распространённых инфекций, как менингококковая, стрептококковая, H. influenzae. Целый ряд вакцин, в том числе для профилактики стафилококковых, эшерихиозных, псевдомонадных и других инфекций находится в разработке. Новейшие исследования привели к смене парадигмы, описывающей механизм действия конъюгированных вакцин, что привело к значительному росту объёма работ в данной области. Создание отечественной платформы для разработки и испытаний конъюгированных вакцин окажет влияние как на развитие фундаментальной иммунологии патогенов, так и на расширение инновационных производств импортозамещающих и полностью новых иммунобиологических препаратов, в том числе экспортно-ориентированных. Препарат конъюгированной вакцины, созданный в ходе данного проекта будет направлен на доклинические испытания, на его основе будет разработан прототип фармацевтического вакцинного препарата на базе ООО «ГРИТВАК». Белковые антигены-носители, исследованные в ходе проекта, будут использованы для создания других конъюгированных вакцин. Коммерциализация полученных препаратов будет заключаться как в разработке и дальнейшей продаже вакцины, так и в коммерциализации белков-партнёров для создания вакцин. Научные и клинические данные, полученные в ходе выполнения работ в данной области, несомненно, расширят базу для международного сотрудничества.
Фактическим рынком сбыта препарата вакцины будет РФ, предполагаемые рынки сбыта включают в себя страны Средней и Юго-Восточной Азии, а также, возможно, некоторые страны Африки. Суммарная емкость рынка на этих направлениях составляет не менее 100 млн. долл. в год. Планируется занять не менее 20% рынка, при этом в течение 5 лет ожидаемый рост рынка при успешном применении вакцины может составить 60-100%. На внутреннем рынке объём продаж может составить несколько (до 5-7) млн. долл. в год, на рынке среднеазиатских республик до 10 млн. долл. в год в 5-летней перспективе, предполагаемые сроки окупаемости – 3-4 года. Информация о новых вакцинах, разработанных в РФ, будет способствовать популяризации российской науки и медицинской биотехнологии.

На II этапе выполнения проекта были получены штаммы-продуценты рекомбинантных белковых антигенов-партнеров для конъюгации – дифтерийного анатоксина CRM197, флагеллина fliC и его фьюжн-производного с мембранным белком сальмонелл pagN, экзотоксина А синегнойной палочки repA. Белки-партнеры для конъюгации были наработаны в гетерологичной системе экспрессии в E.coli и очищены методами ВЭЖХ. Уровень продукции белковых антигенов-партнеров составил 50-100 мг с литра бактериальной культуры. Были проведены изучение физико-химических характеристик и оценка пирогенности белковых антигенов-партнеров для конъюгации. Чистота белковых препаратов, оцененная на основе методов ДСН-ПААГ с окрашиванием бриллиантовым голубым Кумасси и денситометрии, составила 95%, а содержание эндотоксина в препаратах не превышало 5 IU на 1 мг белка. Технология получения рекомбинантных белковых антигенов-партнеров была обоснована с указанием векторов для создания экспрессионных конструкций и штаммов для продукции рекомбинантных белков.
Была проведена сравнительная оценка вариантов возможных способов получения конъюгированной вакцины на основе рекомбинантных белков-стимуляторов иммунного ответа с учетом исследований, проводившихся по аналогичной тематике.
На III этапе выполнения проекта проведена разработка нового технического принципа создания конъюгированной вакцины на основе синтеза тиоэфиров Vi-антигена в безводных условиях в присутствии DCC и ароматических тиолов. Определена оптимальная технология ковалентной конъюгации белка с Vi-антигеном S. typhi, включающая модификацию тиоэфира Vi-антигена аминопроизводным DIBO-алкина и модификацию белка-носителя N-гидроксисукцинимидным производным азида с последующей клик-химической конъюгацией Vi-антигена и белка-носителя. С применением данной технологии конъюгации получены экспериментальные образцы конъюгированной брюшнотифозной вакцины в вариантах СRM197-Vi антиген S.typhi, fliC-Vi антиген S.typhi, fliC:pagN-Vi антиген S.typhi и repA-Vi антиген S.typhi.
С использованием разработанной методики оценки эффективности конъюгации и качества полученных конъюгатов было показано, что выход конъюгата составляет 50-70% по Vi-антигену и 50-60% по белку-партнеру. В тестах на кроликах было подтверждено, что полученные конъюгаты апирогенны и нетоксичны. Результативность разработанного метода конъюгации соответствуют литературным данным о наиболее эффективных способах получения вакцинных конъюгатов полисахаридов с иммуногенными белками-партнерами [Патент WO2015029056, статья PMC4163788].