Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка диагностического набора, основанного на принципе конкурентного иммуноферментного анализа, для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии

Номер контракта: 14.604.21.0068

Руководитель: Голицын Сергей Павлович

Должность: Руководитель отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма и проводимости сердца Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ "РКНПК" Минздрава России

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
аутоиммунный, антиген, рецептор, идиопатичекие нарушения ритма и проводимости сердца, β1-адренорецептор, аутоантитела, клетки млекопитающих, трансфекция, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ (ифа), конкурентное связывание, плазмидная конструкция, генная инженерия, вектор, экспрессия, рекомбинантные белки.

Цель проекта:
1. Несмотря на достижения в течение последних лет в области диагностики и лечения нарушений ритма сердца, раннее установление диагноза и определение тактики лечебных мероприятий в зависимости от патогенетических механизмов развития желудочковых нарушений ритма сердца остается по-прежнему cерьезной клинической и социальной проблемой. Выявление желудочковых нарушений ритма сердца является серьезным поводом для тщательного обследования с применением комплекса дорогостоящих методов диагностики. Однако установить причину желудочковых нарушений ритма сердца зачастую довольно сложно, в связи с чем патогенетически обоснованная терапия не назначается, а проводится паллиативное лечение, что ведет к прогрессированию заболевания и, следовательно, ранней инвалидизации молодых пациентов трудоспособного возраста. Одной из актуальных проблем современной аритмологии является исследование воспалительного поражения миокарда аутоиммунного и инфекционного генеза как патогенетической основы развития и поддержания нарушений ритма сердца. Диагностика изменений в иммунной системе является важным инструментом, позволяющим своевременно назначать комплексные лечебно-профилактические мероприятия, предупреждающие развитие нарушений ритма и первичных заболеваний миокарда. Особенно актуальна проблема мониторинга аутоантител к β1-адренорецептору. Несмотря на множество попыток, до сих пор в мире не удалось создать доступных коммерческих наборов для подобного диагностикума. 2. Для решения вышеописанной проблемы в рамках реализуемого проекта поставлены следующие цели: - Разработать высокочувствительный метод определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору, основанный на принципе конкурентного иммуноферментного анализа, и создать лабораторный прототип соответствующего диагностического набора. - Определить уровень аутоантител к β1-адренорецептору у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии и сопоставить его с данными лабораторно-инструментального обследования.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов.
- Будет создан лабораторный прототип диагностического набора для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в крови пациентов методом конкурентного ИФА с использованием экспрессирующих рекомбинантный β1-адренорецептор иммобилизованных клеток в качестве твердофазного носителя антигена в его природной конформации.
- Будет разработана методика определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в образцах плазмы или сыворотки крови пациентов и составлен проект инструкции по применению диагностического набора.
-Будут получены результаты изучения эффективности лабораторного прототипа диагностического набора для диагностики аутоиммунных изменений у больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии.
- Будет установлен характер связи между наличием аутоантител к β1-адренорецептору и развитием определенных сердечно-сосудистых патологий.

2. Основные характеристики планируемой научно-технической продукции.
- Прототип диагностического набора будет сконструирован для анализа не менее 10 образцов на одном планшете. Набор предназначен только для диагностики in vitro.
- В состав диагностического набора войдут:
а) иммуносорбент: 96-луночный планшет для ИФА с иммобилизованными клетками, экспрессирующими рекомбинантный β1-адренорецептор человека;
б) препарат с фиксированной концентрацией мышиных моноклональных антител, специфических ко второй внеклеточной петле β1-адренорецептора;
в) система иммуноферментного выявления сорбированных мышиных иммуноглобулинов;
г) отрицательная контрольная проба плазмы крови человека, не содержащая аутоантител к β1-адренорецептору человека;
д) положительная контрольная проба плазмы крови человека, содержащая антитела к β1-адренорецептору человека.
- Уровень аутоантител в образце плазмы или сыворотки крови будет определяться по степени конкуренции с мышиным моноклональным антителом за связывание с клетками-носителями антигена.
- Клетки млекопитающих, трансфицированные плазмидной конструкцией с геном β1-адренорецептора человека, будут экспонировать на своей поверхности в среднем не менее 5000 молекул рекомбинантного β1-адренорецептора на клетку.
- Клетки-продуценты мышиного моноклонального антитела к β1-адренорецептору будут производить и секретировать не менее 10 мкг антитела в расчете на 1 миллион клеток за 24 ч.
- В процессе выполнения анализа будет смываться не более 20% иммобилизованных клеток.
- Время подготовки к работе будет составлять не более 1 часа, а общее время проведения анализа – не более 30 часов.


Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Диагностический набор для определения уровня аутоантител к β1-адренорецептору позволит своевременно выявлять аутоиммунные изменения у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца. Подтверждение роли аутоиммунных механизмов в развитии нарушений ритма сердца и других сердечно-сосудистых патологий у определенных категорий больных может стать обоснованием применения терапевтической иммунокоррекции (иммуносорбция аутоантител, иммуномодулирующая терапия) как составной части противоаритмического лечения, а периодический мониторинг уровня аутоантител к β1-адренорецептору позволит оценивать эффективность лечения у конкретного больного.

2. Аналоги предлагаемой разработки – коммерчески доступные диагностические наборы для определения аутоантител к β1-адренорецептору методом конкурентного ИФА с использованием в качестве твердофазного носителя антигена клеток млекопитающих, трансфицированных рекомбинантным геном β1-адренорецептора человека, – в настоящее время отсутствуют.

3. Предлагаемый диагностический набор основан на принципе конкурентного иммуноферментного анализа "третьего поколения", считающегося золотым стандартом для определения аутоантител к поверхностным белкам клеток человека. Характерным преимуществом конкурентного ИФА являются более высокие показатели диагностической специфичности и чувствительности по сравнению со стандартным методом пептидного ИФА. В настоящее время в мире существует единственный коммерчески доступный набор подобного рода, служащий для определения аутоантител к рецептору тиреотропного гормона. Несколькими группами ученых активно разрабатываются подходы к созданию диагностических наборов для определения аутоантител-агонистов к β1-адренорецептору как методом конкурентного ИФА третьего поколения, так и путем совершенствования ИФА на основе пептидных антигенов.

4. Для достижения заявленных результатов планируется следующее.
- Провести оптимизацию и синтезировать гены тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела, специфического к природной конформации второй внеклеточной петли β1-адренорецептора человека.
- Сконструировать эффективный двухкассетный вектор и встроить в него синтезированные гены.
- Провести трансфекцию клеток млекопитающих и получить стабильную клеточную линию, способную производить рекомбинантное моноклональное антитело к β1-адренорецептору.
- Синтезировать оптимизированный ген β1-адренорецептора человека, провести трансфекцию клеток, исходно не имеющих β1-адренорецептора, и получить стабильную линию клеток, экспрессирующих на своей поверхности рекомбинантный β1-адренорецептор. Возможным ограничением здесь является негативное влияние избыточного количества адренорецепторов на жизнедеятельность клеток.
- Разработать метод радиолигандного анализа для определения представленности β1-адренорецептора на поверхности клеток млекопитающих, при помощи данного метода продемонстрировать эффективность и стабильность экспрессии β1-адренорецептора в полученной линии клеток.
- Разработать метод иммобилизации клеток млекопитающих на планшете для ИФА. Иммобилизация клеток должна быть достаточно надежной, чтобы обеспечить возможность проведения всех процедур анализа и воспроизводимость результатов.
- Подобрать параметры, отработать условия и составить протокол лабораторного метода определения аутоантител с использованием экспрессирующих β1-адренорецептор иммобилизованных клеток в качестве твердофазного иммуносорбента, а в качестве конкурентных антител – рекомбинантных мышиных моноклональных антител к β1-адренорецептору. Возможные низкие титры аутоантител к адренорецептору вызывают необходимость использования малых концентраций моноклональных антител-конкурентов, что может потребовать значительного увеличения времени реакции. Кроме того, не исключено, что с данными моноклональными антителами будет способна конкурировать лишь определенная фракция аутоантител-агонистов.
- Провести отбор и клиническое обследование групп больных с идиопатическими нарушениями ритма и проводимости сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии, сформировать банк биообразцов обследованных больных и соответствующую базу данных.
- Провести измерения уровня аутоантител к β1-адренорецептору в собранных биообразцах при помощи разработанного прототипа диагностического набора и методом стандартного ИФА с использованием пептидных фрагментов β1-адренорецептора, проанализировать и сравнить полученные результаты.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Планируемые результаты исследования позволят создать диагностический набор, который в будущем сможет быть использован в специализированных медицинских учреждениях для определения аутоиммунных изменений у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца.

2. В рамках исследования будут проведены лабораторные испытания созданного прототипа диагностического набора на коллекции биообразцов, полученных от больных с нарушениями ритма и проводимости сердца. Результаты будут сопоставлены с особенностями анамнеза, клинического течения, показателями хронотропной функции сердца, данными инструментального обследования (в том числе с данными МРТ сердца с гадолинием), а также выраженностью и характером проявлений желудочковой эктопической активности у данных категорий больных, что позволит установить диагностическую и прогностическую ценность данного иммунологического показателя для клинической аритмологии. В перспективе созданный диагностический набор позволит проводить раннее выявление аутоиммунных изменений у данных категорий больных. Подтверждение роли аутоиммунных механизмов в развитии нарушений ритма сердца и других сердечно-сосудистых патологий у определенных категорий больных может стать обоснованием применения терапевтической иммунокоррекции (иммуносорбция аутоантител, иммуномодулирующая терапия) как составной части противоаритмического лечения и позволит оценивать эффективность лечения у конкретного больного.

3. Разработка твердофазного ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка человека, экспрессированного на поверхности иммобилизованных клеток, окажет существенное влияние на развитие нового поколения диагностикумов для определения аутоантител за счет использования антигенных детерминант, максимально приближенных по своим свойствам к нативным, что позволит принципиально увеличить специфичность определения аутоантител. Высокоэффективный двухкассетный плазмидный вектор, содержащий ряд дополнительных функциональных элементов, можно будет использовать в технологии производства других рекомбинантных моноклональных антител диагностичнского или терапевтического назначения.

Текущие результаты проекта:
1. Синтезированы оптимизированные гены тяжелой и легкой цепей мышиного и химерного (мышь/человек) моноклонального антитела 23-6-7 к β1-адренорецептору. Правильность синтеза проверена секвенированием.
2. Сконструирован высокоэффективный двухкассетный экспрессионный вектор pDC. Эффективность вектора продемонстрирована на модельных генах зеленого и красного флуоресцентных белков.
3. Изготовлены плазмидные конструкции pDC-mAB2367 и pDC-hAB2367 для продукции, соответственно, мышиного и химерного рекомбинантного антитела к β1-адренорецептору в клетках млекопитающих. Правильность сборки удостоверена рестрикционным анализом.
4. Функциональная активность плазмидных конструкций подтверждена методом транзитной трансфекции клеточной культуры НЕК293.
5. Продемонстрировано эффективное связывание мышиного и химерного рекомбинантных антител с пептидом β8, представляющим собой фрагмент второй внеклеточной петли β1-адренорецептора человека.
6. Синтезирован оптимизированный ген β1-адренорецептора человека (ADRB1opt).
7. Изготовлена плазмидная конструкция pMC4IPW ADRB1opt для экспрессии рекомбинантного β1-адренорецептора в клетках млекопитающих.
8. Экспонирование рекомбинантного β1-адренорецептора на поверхности клеток, трансфицированных плазмидой pMC4IPW ADRB1opt, показано при помощи окрашивания клеток рекомбинантными антителами с последующим цитофлуориметрическим анализом.
9. Разработана методика определения содержания β1-адренорецептора на поверхности клеток млекопитающих методом радиолигандного анализа. Чувствительность метода составляет 1800 молекул на клетку при уровне достоверности 99%.
10. По материалам разработки подана заявка на патент: "РАДИОЛИГАНДНЫЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РЕЦЕПТОРНОЙ АКТИВНОСТИ β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ НА ПОВЕРХНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА".
11. Подобраны оптимальные условия и разработана методика иммобилизации клеток млекопитающих на планшете для ИФА путем фиксации глутаровым альдегидом. Потери клеток на стадии иммуноферментного анализа составляют менее 6% при сохранности антигена около 70%.
12. Продолжено формирование трех основных групп больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца. К настоящему моменту в исследование включено 55 пациентов, у которых органической патологии сердца не выявлено (идиопатические нарушения ритма сердца); 21 пациент с ишемической болезнью сердца; 15 пациентов с дилатационной кардиомиопатией воспалительного генеза. Начато формирование двух групп сравнения – группы больных с ишемической болезнью сердца при отсутствии нарушений ритма (обследовано 5 человек) и группы здоровых добровольцев (обследовано 13 человек). Всем пациентам проведено клинико-инструментальное обследование согласно протоколу.