Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
биокатализ, каталитические антитела, биотехнология, комбинаторные библиотеки, клеточный дисплей, pichia pastoris

Цель проекта:
Цель работы: создание на основе генов иммуноглобулинов и ферментов биокатализаторов с заранее заданными улучшенными свойствами для обеспечения их пролонгированной работы в токе крови в качестве лекарственных средств или использования в биотехнологии.

Основные планируемые результаты проекта:
1). Получение оригинальных вектор-генетические конструкций для экспрессии генов ферментов и каталитических антител на поверхности дрожжевой клетки и во внеклеточное пространство; создание лабораторных методик экспрессии генов биокатализаторов на поверхности дрожжевой клетки и скрининга индивидуальных клеток методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/вода; получение библиотек активных центров ферментов бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), энтерокиназы (ЭК) и каталитических антител A17 и/или A5 и создание лабораторная методики скрининга библиотек активных центров биокатализаторов методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/вода; создание лабораторных методик получения химически полисиалированых рекомбинантных биокатализаторов и получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов; наработки экспериментальных партий лучших вариантов биокатализаторов, производных БуХЭ, ЭК, каталитических антител A17 и/или A5 и лучших вариантов химически полисиалированных биокатализаторов, производных БуХЭ, дезокисрибонуклеазы (ДНКазаI), каталитических антител A17 и/или A5; создание программной документация на алгоритм предсказания наиболее активных мутантов с улучшенными потребительскими свойствами и в последствии проекта технического задания на ОТР по доклиническому исследованию новых биокатализаторов.
2). Получаемые в ходе исследований вектор-генетические конструкции должны обеспечивать синтез функционально активных рекомбинантных биокатализаторов на поверхность дрожжевых клеток; вектор-генетические конструкции для экспрессии на поверхности должны содержать гены мембранных «якорей» Aga и Sed; в вектор-генетических конструкциях гены различных белков (флуоресцентный маркер, цепи антитела, фермент) должны находиться под управлением единого промотора, и между собой содержать последовательность F2А-пептида; конструкции должны быть оригинальными и не иметь прямых аналогов в мире.
Разрабатываемая лабораторная методика экспрессии генов биокатализаторов на поверхности дрожжевых клеток должна обеспечить представление не менее 500 молекул биокатализатора в пересчете на одну клетку; разрабатываемая микрофлюидная технология для упаковки клеток с биокатализаторами на поверхности в состав двукратной эмульсии вода/масло/вода должна обеспечить наличие не более 5 клеток в капле эмульсии; разрабатываемая методика скрининга индивидуальных клеток методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS) в двойных эмульсиях должна обеспечить упаковку одиночных клеток в капли с выходом не менее 90%.
Создаваемые библиотеки активных центров биокатализаторов должны иметь представительность не менее 104 вариантов; в процессе скрининга библиотеки должно быть отобрано не менее 10 вариантов для дальнейшего энзимологического и физико-химического исследования.
Лабораторная методика получения химически полисиалированых препаратов рекомбинантных биокатализаторов должна приводить к получению продуктов с сохранением не менее 70% специфической удельной активности; лабораторная методика наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов должна обеспечить чистоту белкового препарата не менее 95%; создание новых биокатализаторов с улучшенными потребительскими свойствами (ферментативными и/или фармакодинамическими) должно быть проведено на основе следующих ферментов и каталитических антител:
- бутирилхолинэстераза (БуХЭ) - фермент, являющийся мишенью для фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ);
- дезокисрибонуклеаза (ДНКазаI) - фермент, применяемый для терапии муковисцидоза;
- каталитические антитела (А17 и/или А5), обладающие эстеролитической активностью в отношении ряда ФОВ, аналогов зомана и пестицида параоксона;

- энтерокиназа (ЭК) - фермент, способный эффективно и специфически процессировать биотехнологически важные слитные белки.
Получаемые биокатализаторы (БуХЭ, ЭК, A17/A5) должны иметь каталитическую эффективность по отношению к субстратам не менее, чем на 50 % выше каталитической эффективности соответствующих исходных ферментов и каталитических антител. Время полувыведения из кровотока полисиалированных биокатализаторов (БуХЭ, ДНКазаI, A17/A5) должно быть не менее, чем в 2 раза выше времени полувыведения соответствующих исходных биокатализаторов; предсказательный алгоритм QM/MM и MD компьютерных расчетов должен позволять проводить расчеты не менее 104 структур в месяц с использованием возможностей суперкомпьютеров; исследования биологической активности и безопасности должны быть проведены не менее, чем для 2 новых биокатализаторов, один из которых должен быть полисиалированным.


Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Полученные вектора оригинальны и не имеют прямых аналогов в мире. Разработана система скрининга индивидуальных клеток методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS). Для адаптации метода для скрининга биокатализаторов использована эмульсионная система вода/ масло/вода. Разработанный метод может быть использован как для скрининга библиотек биокатализаторов, так и для фундаментальных исследований биохимических процессов проходящих в примембранной области. Проведен скрининг библиотек биокатализаторов с последующим всесторонним структурно-функциональным анализом отобранных клонов. В результате отбора получены биокатализаторы с улучшенными кинетическими характеристиками и специфичностью.
Полученные данные могут дать ответы на фундаментальные вопросы энзимологии об эволюции активного центра фермента и найти прикладное применение для защиты организма от патогенных высокомолекулярных соединений. Получение искусственных ферментов, возможно осуществлять с применением рационального дизайна и методов комбинаторной биологии. В проекте предлагается с помощью высокоэффективных скрининговых технологий, основанных на ковалентном взаимодействии скрининрующего агента и фаговой частицы и рационального дизайна предполагающего получение отображения активного центра биокатализатора получить биокатализаторы широкой специфичности, способные превращать биополимеры и взаимодействовать с фосфорорганическими веществами, аналогами отравляющих веществ (ОВ). Особенностью методического подхода, применяемого в проекте является использование системы эукариотической экспрессии иммуноглобулинов в виде полноразмерной молекулы в клетках СНО. При этом все проблемы неправильного фолдинга, ставящие под сомнение получение кристаллов антител элиминируются. Предлагаемая технология применяется уже на западе, но по имеющимся у нас сведениям она не столь распространена в России. В нашей лаборатории эта технология находится на потоке и активно применяется в рамках этого проекта.
Развитие технологии эукариотической экспрессии антител имеет определенное биотехнологическое значение, т.к. может быть использовано в фарминдустрии, поскольку конечной целью проекта является практическая задача - получение антидотов против фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ). В этой связи оптимизация условий экспрессии селектированных антител превращается в самостоятельную большую проблему. В качестве следующего методического подхода использованы методики белковой химии и практической биохимии, а именно ферментативный процессинг антител с целью получения Fab фрагментов и их хроматографическая очистка с применением ВЭЖХ.
Для улучшения потенциальных фармакологических свойств биокатализаторов использованы методы химического полисиалирования белковой молекулы.
В дальнейшем ряд наиболее эффективных селективных биокатализаторов будут закристаллизованы. После получения кристаллической структуры этих биокатализаторов и с помощью рентгеноструктурного анализа предполагается получить их трехмерные изображения. Путем инкубации кристаллов с субстратами будут получены кристаллические формы модифицированных антител. Методами молекулярного моделирования, молекулярной динамики и квантово-механических подходов (MD, QM) с использованием техники "докинга" будут построены 3D модели функционально активных антител и предсказаны наиболее активные мутанты с улучшенными потребительскими свойствами. Планируется исследовать молекулярные механизмы катализа и сделать выводы о возможности повышения эффективности биокатализатора. С применением кинетических методов, с использованием масс-спектрометрии будет исследовано взаимодействие антител с потенциальными субстратами. Применение методов микрокалориметрии позволит количественно оценить взаимодействие антител с низко- и высокомолекулярными субстратами и составить энергетическую картину рассматриваемых превращений. С применением техники рекомбинантных ДНК и на основе данных 3D будут получены мутантные формы антител. Исследование их активности, возможно, позволит сделать более глубокие выводы о механизме катализа.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Область применения - медицина, фармакология, биотехнология, нейробиология, биохимические исследования.
Задачи биотехнологии и фундаментальные проблемы биокатализа делают актуальным проблему создания новых биокатализаторов, способных превращать биополимеры и взаимодействовать с фосфорорганическими веществами, аналогами отравляющих веществ (ОВ). Практическим результатом является создание "каталитически активного антидота" к фосфорорганическим ОВ. Получение потенциальных лекарственных средств пролонгированного действия. Функциональный скрининг библиотек генов создает системы экспрессии кодируемых ими белков и детекции активности последних. В данном проекте решается задача экспрессии репертуара генов, кодирующих биокатализаторы на поверхности клеток дрожжей P. pastoris и системы отбора биокатализаторов с оптимальными заранее заданными свойствами.
Возможные потребители результатов исследования: Минпромторг РФ, Минобороны РФ, МВД РФ, МЧС РФ, Минздрав РФ, университеты и вузы РФ, Научно-исследовательские профильные институты, фармацевтические компании.

Текущие результаты проекта:
1. По данным научно-технической литературы было установлено, что комбинаторный подход, основанный на скрининге фаговых или клеточных библиотек, можно рассматривать в качестве эффективной стратегии для получения искусственных биокатализаторов de novo. Полученные ферменты можно использовать в качестве матрицы для дальнейшего рационального дизайна на основе анализа трехмерной структуры белка. Виртуальный скрининг мутантов с новой / улучшенной функциональностью может быть произведен путем сочетания метода молекулярной динамики и метода квантовой механики / молекулярной механики.
2. По результатам патентного поиска дальнейшие исследования и практические разработки в области рекомбинантных биокатализаторов являются своевременными и перспективными, а патентование таких препаратов, способов их получения и методик модификации их биологической активности является целесообразным. Принципы создания основаны на использовании современных техник скрининга комбинаторных библиотек, компьютерного моделирования и квантово-механических расчетов. Наблюдаемые тенденции в абсолютном большинстве запатентованных способов получения рекомбинантных биокатализаторов относится к синтезу в клетках лини CHO в виде полноразмерных или «урезанных» вариантах, предлагаемые методы модификации опираются на химическую или ферментативную конъюгацию белковых препаратов с гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или аналог, или полисиаловая кислота.
3. Создана панель модельных биокатализаторов, экспрессирующихся на поверхности дрожжевой клетки (ферменты: бутирилхолинэстераза, энтерокиназа, ДНКазаI; каталитическое антитело А17) и конструкции для исследования влияния генетических элементов (лидерный пептид, промотеры и последовательность «якоря») на эффективность продукции биокатализаторов на поверхности клетки. Получены генетические конструкции GAPcherry2Ahsa/L-HEP/HAanchor, GAPcherry2Ahsa/BuchE/HAanchor и GAPcherry2Ahsa/DNA/HAanchor, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую цепь энтерокиназы, бутирилхолинэстеразу и ДНКазуI человека, соответственно. Встраивание целевых нуклеотидных последовательностей в дрожжевой геном было подтверждено флуориметрически и продемонстрировало существенные преимущества использования индуцибельного промотора AOX1 по сравнению с конститутивным GAP промотором в случае каталитических антител. В конструкциях гены различных белков (флуоресцентный маркер, цепи антитела, фермент) находятся под управлением единого промотора, и между собой содержат последовательность F2А-пептида. Конструкции оригинальны и не имеют прямых аналогов в мире.
4. Было показано, что лидерные пептиды α-амилазы (amy) и укороченного альфа-фактора (alpha-short) обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого белка трансформированных клеток и могут использоваться для создания библиотек антител и абзимов. Мы определили генетические элементы, обеспечивающие максимальное представление биокатализатора на поверхности клетки и оптимизировали условия экспрессии, повысив уровень продукции целевого белки и сократив время. В дальнейшей работе по созданию библиотек биокатализаторов методом дрожжевого дисплея будут использоваться AOX1 промотор, последовательность субъединицы агглютинина SAG1 и лидерный пептид человеческого сывороточного альбумина hsa; индукция экспрессии биокатализаторов метанолом будет проводиться при стартовой плотности ОП600=5.0, а анализ клеток будет производиться на следующий день.
5. Наличие ферментов (энтерокиназы, бутирилхолинэстеразы или ДНКазыI человека) на поверхности клеток установили с помощью покраски специфическими антителами с последующим их анализом методом флуоресцентной микроскопии; сохранение их функциональной активности подтвердили наличием ферментативной реакции с соответствующими специфическими субстратами. На основании проведенных экспериментов можно сделать однозначный вывод о том, что созданные генетические конструкции и разработанная лабораторная методика экспрессии генов биокатализаторов позволяют получать функционально активные ферменты бутирилхолинэстеразы, энтерокиназы и ДНКазыI, а также каталитические антитела на поверхности дрожжевых клеток. Необходимо отметить, что использованная методология универсальна для локализации разных типов активных биокатализаторов на поверхности дрожжевой клетки.
6. В ходе проделанной работы нам удалось создать микрофлюидную систему для высокопроизводительной генерации стабильной монодисперсной двойной эмульсии. Полученная в результате методика позволяет осуществить компарментализацию индивидуальных клеток Pichia рastoris, сохраняя их выживаемость и обеспечивая возможность протекания реакции, катализируемой биокатализатором, экспонированным на поверхности живой клетки и обеспечивает наличие не более 5 клеток в капле эмульсии.
7. Была разработана методика скрининга индивидуальных клеток методом проточной цитофлуориметрией – сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/вода, которая обеспечила упаковку одиночных клеток в капли с выходом не менее 90%, и получены новые чипы для генерации монодисперсной двойной эмульсии диаметром 20 мкм. Была показана эффективная генерация капель с частотой 20 кГц, что на порядок выше, чем в случае ранее полученных 65 мкм капель. Была произведена запаковка дрожжевых клеток в капли двойной эмульсии, а также произведены пробные отборы капель, в которых протекала реакция, катализируемая ферментом, заякоренным на поверхности дрожжевой клетки. Было показано, что клетки, обладающие низкой флуоресценцией внутриклеточного белка-репортера mСherry обладают пониженной выживаемостью. С использованием комплексной среды BMH нам удалось добиться 90-120% выживаемости клеток при высевании сразу после их запаковки.
8. Предсказательный алгоритм QM/MM и MD компьютерных расчетов позволил проводить расчеты не менее 104 структур в месяц с использованием возможностей суперкомпьютеров. При введении одной, двух или трех замен в активный центр А17 число мутантов составляет 35336. Используя как критерий для ММ образование водородных связей с параоксоном (субстрат А17) и оттягивание протона от тирозина (увеличение нуклеофильности в активном центре А17) мы получили порядка 375 мутантов, удовлетворяющих этим требованиям. Все они были проанализированы с помощью КМ метадинамики на возможность образования переходного состояния. В результате работы по проведению компьютерного моделирования и QМ/ММ и MD расчетов для определения аминокислотных остатков, участвующих в организации активного центра ферментов и каталитических антител, мы выяснили, что 35 и 47 положения – лучшие для замены. Замены в этих положениях активного центра ферментов и каталитических антител на кислые аминокислоты не приводит к образованию ковалентного интермедиата, а большее число удачных запусков случалось при замене на основные аминокислоты – аргинин, лизин, гистидин. Замена серина в положении 35 легкой цепи каталитических антител на аргинин приводит к образованию сетки водородных связей (позиционирование параоксона в активном центре) с вероятностью образования переходного состояния больше 80%.
9. Были проведены дополнительные патентные исследования по теме поиска: «Способы получения и применения бутирилхолинэстеразы человека», - обнаружено и просмотрено свыше 150 источников патентной информации, из них для дальнейшего анализа отобрано 32 охранных документа.
Анализ отобранной в процессе поиска научно-технической и патентной литературы демонстрирует высокий интерес исследователей и крупнейших фармацевтических компаний мира к новым методам получения, модификации и применения БуХЭ, а также ее ингибиторов для терапии когнитивных, нейродегенеративных процессов, болезни Альцгеймера, онкологии и отравления фосфорорганическими токсинами. Таким образом, дальнейшие исследования и практические разработки в области получения, модификации и применения БуХЭ являются своевременными и перспективными, а патентование таких методов их получения и методик модификации их биологической активности является целесообразным.