Регистрация / Вход
Прислать материал

Экспериментальное моделирование и разработка ранней диагностики болезни Паркинсона.

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
мозг, дофаминергическая система, нейродегенеративные заболевания, болезнь паркинсона, моделирование, биомаркеры, ранняя диагностика

Цель проекта:
Цель: Создание хронических моделей доклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона и разработка методов комплексной ранней диагностики заболевания. Задачи: 1. Создание хронической модели доклинической стадии болезни Паркинсона (БП) (деградация дофаминергической нигростриатной системы не достигает порогового уровня, при котором появляются первые нарушения двигательной активности) на мышах с помощью 1-метил,4-фенил,1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) и оценка гибели нейронов и компенсаторных механизмов в нигростриатной системе мозга. 2. Создание хронической модели ранней клинической стадии БП (деградация дофаминергической нигростриатной системы достигает порогового уровня, при котором появляются первые нарушения двигательной активности) на мышах с помощью МФТП и комплексная оценка гибели нейронов и компенсаторных механизмов в нигростриатной системе мозга. 3. Оценка функционального состояния отделов мозга за пределами нигростриатной системы и периферических органов на модели доклинической стадии БП. 4. Поиск биомаркеров в крови на моделях доклинической и ранней клинической стадий БП как основа для создания ранней диагностики БП. 5. Экспериментальная разработка провокационного теста диагностики БП на модели доклинической стадии. 6. Обоснование возможности разработки комплексной диагностики БП на доклинической стадии заболевания на основе биомаркеров и фармакологического провокационного теста.

Основные планируемые результаты проекта:
В рамках проекта предполагается разработать две хронические модели болезни Паркинсона (БП): доклинической и ранней клинической стадий с помощью предшественника нейротоксина – 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП). Данные модели планируется разрабатывать на основе представлений о патогенезе заболевания, согласно которым БП в течение длительного времени развивается без нарушений двигательной функции, что связано с достаточно медленной деградацией дофаминергических нейронов нигростриатной системы и развитием компенсаторных процессов в мозге. Известно, что симптомы появляются после гибели половины дофаминергических нейронов, что приводит к снижению дофамина (ДА) более чем на 80% в стриатуме (место проекции дофаминергических нейронов), т.е. порового уровня деградации нигростриатной системы. Соответственно при моделировании доклинической стадии БП деградация нигростриатной системы не должна достигать порогового уровня, а на модели ранней клинической стадии – должна.
Использование моделей доклинической и ранней клинической стадий БП позволит приблизиться к пониманию клеточных и молекулярных механизмов патогенеза БП у человека путем оценки: (а) скорости деградации нигростриатных дофаминергических нейронов у человека при наличии в его организме сходного по строению и механизму действия эндогенного нейротоксина; (б) клеточных и молекулярных механизмов компенсаторных процессов в нигростриатной системе, направленных на усиление синтеза ДА выжившими дофаминергическими нейронами и недофаминергическими нейронами, экспрессирующими одиночные комплементарные ферменты синтеза ДА, а также на повышение чувствительности нейронов-мишеней к дефицитному ДА; (в) молекулярных механизмов, обусловливающих появление нарушений моторного поведения и переход из досимптомной стадии в симптомную. Авторы проекта надеются также впервые получить доказательства того, что с помощью МФТП можно моделировать не только деградацию нигростриатной дофаминергической системы – ключевого звена патогенеза БП, но и имитировать системный характер заболевания, т.е. распространение патологического процесса по мозгу за пределы нигростриатной системы и на периферию. Было бы особенно важно показать, что эти неспецифические патологические процессы развиваются раньше, чем деградация нигростриатной ДА-ергической системы достигает порогового уровня и появятся нарушения моторного поведения.
Создание и анализ моделей доклинической и ранней клинической стадий БП позволят не только получить новые фундаментальные знания о патогенезе БП, но будут способствовать созданию комплексной диагностики БП на доклинической стадии. Так, у мышей на модели доклинической стадии БП предполагается выявить ряд относительно специфичных биомаркеров в плазме крови в виде изменения содержания моноаминов, гормонов, ростовых факторов и патологических нейротоксических белков, на базе которых в совокупности можно построить раннюю диагностику БП задолго до появления первых моторных симптомов. Используемый нами оригинальный экспериментальный подход к разработке доклинической диагностики БП является комплементарным к поиску биомаркеров в плазме крови у больных сразу же после появления у них симптомов нарушения двигательной функции, но до начала патогенетического лечения, что в настоящее время широко осуществляется в России и в зарубежных странах. Сравнительный анализ биомаркеров, выявляемых в плазме на разработанных нами моделях доклинической и ранней клинической стадий, позволит понять, в какой степени они перекрываются, а значит, в какой степени можно рассчитывать на то, что обнаруженные у больных биомаркеры в плазме на ранней клинической стадии могут служить диагностическими маркерами и у больных на доклинической стадии.
Важнейшим «ноу-хау» в разработке доклинической диагностики БП, не имеющим в мире аналогов, будет создание провокационного фармакологического теста, с помощью которого можно обратимо на короткое время усугубить функциональную недостаточность нигростриатной дофаминергической системы, доведя дефицит ДА в стриатуме до порогового уровня. При этом у животных в опыте, но не в контроле, должны возникнуть обратимые кратковременные нарушения моторного поведения. В качестве такого антагониста ДА предполагается использовать альфа-метил-п-тирозин – обратимый ингибитор тирозингидроксилазы - первого скорость-лимитирующий фермент синтеза ДА, действие которого при введении в организм ограничивается двумя-тремя часами. Перспективность использования этого ингибитора в клинике в качестве провокационного агента обусловлено тем, что он уже используется в клинике, но с другой целью – для лечения таких заболеваний, как феохромоцитома. Это означает, что альфа-метил-п-тирозин прошел в свое время клинические испытания, показавшие не только его эффективность как лекарственного средства, но и отсутствие побочных эффектов. Предполагается, что в результате выполнения проекта на экспериментальном уровне будет решена проблема создания комплексной диагностики БП на доклинической стадии путем сочетания двух упомянутых комплементарных подходов – выявления относительно специфичных биомаркеров в плазме и провокационного фармакологического теста.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Проведенные исследования оригинальны и не имеют аналогов в мировой литературе. Разработанные нами хронические модели доклинической и ранней клинической стадии БП являются уникальными с точки зрения адекватности патогенезу БП у людей.
Предлагаемый комплексный подход разработки диагностики заболевания на доклинической стадии является уникальным исследованием, учитывая, что в большинстве работ используются модели только клинической стадии, в то время как авторами исследования предлагается сравнение доклинической и ранней клинической стадий с целью выявления молекулярных механизмов (триггеров) перехода доклинической стадии БП в клиническую. Эти механизмы могут служить мишенями для новых методов направленной адресной фармакотерапии, являющейся важным аспектом современной трансляционной медицины. В перспективе сравнение полученных данных по оценке показателей плазмы крови (катехоламины, гормоны, белки) при профилатическом осмотре населения позволят выбрать группу риска на доклинической стадии БП, после чего будет применен инновационный подход, который будет разработан в рамках проекта – фармакологический провокационный тест.
В рамках проекта будут разработаны:
1. Хроническая модель доклинической стадии БП на мышах.
2. Хроническая модель клинической стадии БП на мышах.
3. Комплексная диагностика паркинсонизма на экспериментальной модели досимптомной стадии путем использования комплементарных подходов – поиска биомаркеров плазмы крови и фармакологического провокационного теста, что будет являться основной для разработки доклинической диагностики БП у больных в неврологической клинике.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения, способы использования ожидаемых результатов:
1) Созданная в рамках проекта хроническая модель доклинической стадии БП может быть использована для изучения: (а) клеточных и молекулярных механизмов наиболее ранних проявлений дегенерации нигростриатных ДА-ергических нейронов, в первую очередь деградации синаптических терминалей аксонов, (б) клеточных и молекулярных механизмов пластичности мозга, способствующей компенсации функциональной недостаточности нигростриатной системы; (б) хронологии деградации центров мозга за пределами нигростриатной и периферической нервной системы; (в) поиска легко доступных для выявления с помощью неинвазивных или малоинвазивных методов периферических биомаркеров раннего развития заболевания; (г) селекция антагонистов ДА обратимого действия для использования в качестве провокационного теста на функциональную недостаточность нигростриатной ДА-ергической системы.
2) Созданная в рамках проекта хроническая модель клинической стадии БП может быть использована: (а) для поиска триггеров нарушения моторного поведения, т.е. перехода паркинсонизма из досимптомной стадии в симптомную, путем сравнения функционального состояния нигростриатной системы на обеих стадиях; (б) в качестве тест-системы для поиска потенциальных лекарственных веществ, останавливающих или замедляющих гибель нейронов, а также стимулирующих компенсаторные процессы..
3) Экспериментальная разработка комплексной диагностики паркинсонизма на досимптомной стадии путем использования комплементарных подходов – поиска биомаркеров плазмы крови и фармакологического провокационного теста, могут служить основной для разработки доклинической диагностики БП у больных в неврологической клинике.
Возможные потребители ожидаемых результатов:
Результаты и модели полученные в рамках выполнения проекта могут быть использованы:
(а) как новый подход в фундаментальных исследованиях к комплексной оценке молекулярных механизмов нейродегенерции и пластичности мозга;
(б) в фармакологии для скрининга лекарственных веществ, в первую очередь веществ с нейропротекторными свойствами;
(в) в неврологии для разработки комплексной диагностики БП на доклинической стадии.
Разработка доклинической диагностики БП, созданная на основе трансляционной персонализированной и профилактической медицины, будет мощным стимулом для создания доклинической диагностики других фатальных хронических нейродегенеративных заболеваний, в первую очередь болезни Альцгеймера. Более того, появление доклинической диагностики БП откроет новое направление в фармакологии – поиск лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами, эффективных именно на ранней стадии развития заболевания.
Наряду с широко используемой в мире методологией создания комплексной доклинической диагностики нейродегенеративных заболеваний на основе анализа клинических предвестников и поиска относительно специфичных периферических биомаркеров, впервые для диагностики неврологических и психических заболеваний будет использована оригинальная технология, предложенная авторами проекта. В основе этой технологии лежит использование провокационного теста, который позволит обратимо усилить скрытую функциональную недостаточность специфической регуляторной системы мозга до такой степени, что она проявится на короткое время в виде специфических клинических симптомов. Эта методология, широко используемая в других областях медицины, позволит резко сократить временные и финансовые затраты на постановку диагноза у больного на доклинической стадии развития заболевания.
Разработка доклинической диагностики при БП позволит продлить период бессимптомного течения заболевания, т.е. комфортной жизни больного неограниченно долго, возможно, до смерти, вызванной другой причиной. В этом случае будут многократно сокращены расходы на лечение и реабилитацию этих больных.
Создание доклинической диагностики БП и вообще нейродегенеративных заболеваний является глобальной проблемой, стоящей перед человечеством, что обусловливает необходимость широкого международного научного сотрудничества для ее решения. Действительно, для решения этой задачи созданы большие национальные и международные консорциумы, и встает вопрос о создании общей базы данных результатов проведенных исследований в этом направлении (“big data”). Кроме того, описанные выше методологии создания доклинической диагностики БП и других нейродегенеративных заболеваний позволят только создать «группы риска», в пределах которых окончательный диагноз может быть поставлен с помощью позитронно-эмиссионной томографии – ключевого неинвазивного нейровизулизационного метода исследования мозга. Очевидно, что разработка доклинической диагностики послужит триггером для совершенствования этого метода и создания Центров нейровизуализации работы мозга.

Текущие результаты проекта:
В настоящее время отсутствует возможность изучения функционального состояния нигростриатной системы у больных на доклинической стадии БП из-за невозможности диагностирования заболевания до появления специфических моторных симптомов. Поэтому изучение клеточных и молекулярных механизмов функционирования нигростриатной системы в норме и на ранней стадии развития БП возможно только на экспериментальных моделях. При этом для подтверждения адекватности разрабатываемой нами модели доклинической стадии используется сравнение ее с моделями клинической стадии, которые в свою очередь должны быть максимально приближены к патологическим процессам, характерным для нелеченых больных на ранней клинической стадии БП. БП является системным заболеванием – нейродегенеративный процесс охватывает не только нигростриатную систему мозга, патология которой приводит нарушению моторики, но и другие отделы мозга, а также и периферическую нервную систему. В совокупности это приводит к изменению интегративного показателя состояния организма – состава плазмы крови.
Исходя из выше изложенного, в рамках первого этапа данного проекта (2014 г.) была разработана модель доклинической стадии БП на мышах, а в рамках отчетного периода (2015 г.) – модель ранней клинической стадии БП. Эти модели полностью отвечают требованиям по уровню деградации нигростриатной дофаминергической системы. Так, у мышей при моделировании доклинической стадии БП гибель тел дофаминергических нейронов и их терминалей в стриатуме, а также снижение уровня дофамина в стриатуме не достигают порогового уровня, при котором возникают моторные нарушения. Порогом является гибель 50-60% тел нейронов в черной субстанции, деградация 70% терминалей аксонов и снижение дофамина в стриатуме на 80%. При моделировании ранней клинической стадии БП деградация нигростриатной дофаминергической системы достигает или даже незначительно превышает пороговый уровень, что сопровождается нарушением моторного поведения. Данные модели, в отличие от большинства моделей БП на грызунах, воспроизводят одну из важнейших особенностей этого заболевания – хроническое течение. В мире существует всего несколько работ, в которых пытались воспроизвести дегенерацию дофаминергических нейронов в хроническом опыте, однако авторы не ставили перед собой задачу смоделировать доклиническую и раннюю клиническую стадии БП и провести их сравнительный анализ, что явилось целью данного проекта. Именно сравнительный анализ этих моделей позволит найти биомаркеры ранних патологических процессов, особенно на периферии, что послужит основой для разработки диагностики БП на доклинической стадии.
Хроническую модель доклинической стадии БП, разработанную на первом этапе проекта, создали путем введения предшественника специфического нейротоксина дофаминергических нейронов – МФТП в течение 5 недель в дозе 10 мг/кг (однократно каждую неделю), что приводило к снижению уровня дофамина в стриатуме на 70% без нарушения двигательной функции животных. Учитывая то, что БП является системным заболеванием, а нейродегенерация затрагивает не только нигростриатную систему, но и другие отделы мозга, а также периферическую нервную систему и внутренние органы, в отчетный период была проведена оценка органических и метаболических изменений в других моноаминергических системах мозга и в надпочечниках на хронической модели доклинической стадии БП.
В качестве анализируемых моноаминергических систем мозга были выбраны серотонинергические нейроны, тела которых локализованы в ядре шва, и норадренергические нейроны голубого пятна. Определение концентрации норадреналина и серотонина проводили в стриатуме – в области локализации терминалей аксонов этих нейронов. Изменений по этим показателям не было обнаружено. Также не были обнаружены признаки изменения метаболизма катехоламинов в хромаффинных клетках мозгового вещества надпочечников у мышей на доклинической стадии БП, что оценивали по содержанию норадреналина, адреналина и дофамина в надпочечниках. Из приведенных данных следует, что токсическое действие МФТП на нигростриатную дофаминергическую систему у мышей на модели доклинической стадии БП предшествует его действию на другие моноаминергические системы мозга и на моноамин-продуцирующие периферические органы. Это позволяет предположить, что и у больных на доклинической стадии БП отсутствуют изменения метаболизма моноаминов в мозге, за исключением нигростриатной дофаминергической системы, и в периферических эндокринных органах.
Современная методология разработки диагностики БП на доклинической стадии построена на поиске периферических биомаркеров в виде изменения состава плазмы крови у нелеченых больных на ранней клинической стадии БП. Однако вполне вероятно, что состав плазмы крови меняется по мере прогрессирования заболевания от доклинической стадии до клинической стадии. Отсюда становится очевидным, что поиск биомаркеров должен осуществляться на доклинической стадии с дальнейшей оценкой их наличия и на ранней клинической стадии, что возможно только на экспериментальных моделях. В отчетный период (2015 г.) был проведен анализ состава плазмы крови по ряду показателей на хронической модели доклинической стадии БП, а именно определяли в плазме уровень: катехоламинов и метаболитов, белка альфа-синуклеина и нейротрофических факторов, т.е. тех веществ, которые прямо или косвенно вовлечены в патогенез БП.
Согласно полученным данным, в крови у мышей на хронической модели доклинической стадии уровень норадреналина и дофамина в плазме крови не изменялся, в то время как уровень адреналина был увеличен на 40%, что может рассматриваться как потенциальный биомаркер доклинической стадии у больных при БП. Помимо катехоламинов, у мышей на модели доклинической стадии в плазме было оценено содержание метаболитов - L-ДОФА (промежуточный предшественник синтеза) и ДОФУК (основной продукт деградации). Оказалось, что уровень обоих метаболитов в плазме у мышей на модели доклинической стадии БП значительно снижен по сравнению с контролем, что можно рассматривать как косвенный интегративный показатель деградации симпатической нервной системы. Эти данные хорошо согласуются с предположением неврологов, основанном на анамнезе больных, о том, что деградация симпатической нервной системы и нарушение функций иннервируемых ею внутренних органов характерна для больных на доклинической стадии БП. Для данного проекта особенно важно то, что снижение уровня L-ДОФА и ДОФУК в плазме крови может рассматриваться как потенциальный периферический биомаркер доклинической стадии БП.
Наряду с катехоламинами, у мышей на модели доклинической стадии БП была дана оценка содержания в плазме крови альфа-синуклеина – одного из немногих белков, мутации в гене которого приводят к развитию БП, однако, генетические формы заболевания составляют менее 5% от всех случаев БП. Альфа-синуклеин необходим для нормального функционирования нейронов, однако при БП нарушается его метаболизм в мозге, что приводит к его накоплению и агрегации. По мере агрегирования образуются токсичные фибриллярные комплексы – олигомеры, которые вызывают гибель нейронов, в частности дофаминергических нейронов. Учитывая то, что альфа-синуклеин синтезируется не только в нейронах, но и во многих других клетках, включая лимфоциты крови, нами было измерено содержание альфа-синуклеина в лимфоцитах у мышей на модели доклинической стадии БП. При этом было показано, что у мышей на доклинической стадии содержание альфа-синуклеина в лимфоцитах крови снижено почти вдвое по сравнению с контролем. Это означает, что обнаруженное у мышей изменение содержания альфа-синуклеина в лимфоцитах крови является одним из наиболее достоверных и специфических кандидатов в маркеры БП у больных на доклинической стадии.
Помимо катехоламинов и альфа-синуклеина, в плазме крови у мышей на модели доклинической стадии БП оценивали уровень нейротрофических факторов – нейропептидов, обладающих нейропротекторным действием и стимулирующих репаративные процессы. Для этого были выбраны глиальный нейротрофический фактор и нейротрофический фактор мозга, обладающие наибольшим физиологическим влиянием на дофаминергические нейроны нигростриатной системы. На первом этапе этой работы было показано, что содержание обоих нейротрофических факторов не изменяется в нигростриатной системе, что предполагает их вовлечение в регуляцию репаративных процессов в мозге на более поздней стадии патогенеза БП. Поэтому не удивительным оказалось то, что концентрация нейротрофических факторов в крови оказалась настолько низкой, что находилась за пределами разрешающей способности использованного иммуноферментного анализа.
Следующей задачей, на решение которой был направлена работа в отчетный период, явилась разработка хронической модели ранней клинической стадии БП. Данная модель была получена при введении МФТП в течение 10 недель в дозе 10 мг/кг с усилением. Такая схема введения МФТП приводила к появлению слабо выраженных нарушений моторного поведения животных, что является одним из требований к разрабатываемой модели. При этом, также в соответствии с требованиями к модели, концентрация дофамина в стриатуме снижена на 80%, как и количество тел нейронов и терминалей аксонов в стриатуме достигали порогового уровня.
При этом в стриатуме было показано увеличение «оборота» дофамина, рассчитываемого как отношение содержания метаболита медиатора (ДОФУК) к содержанию самого медиатора (дофамина), что свидетельствует о компенсаторном увеличении дофаминовой нейротрансмиссии. В дальнейшей работе были предприняты попытки определить молекулярные механизмы компенсаторного увеличения дофаминовой нейротрансмиссии в стриатуме. При этом было показано, что у мышей на модели ранней клинической стадии БП в телах дофаминергических нейронов увеличено содержание тирозингидроксилазы, скорость-лимитирующего фермента синтеза дофамина, при неизменном уровне экспрессии гена этого фермента. Отсюда следует вывод о компенсаторном повышении скорости трансляции. Несмотря на увеличение содержания тирозингидроксилазы в телах нейронов, в терминалях аксонов этот показатель снижен, вероятно, за счет нарушения аксонального транспорта, что характерно для патогенеза БП.
Компенсаторное увеличение содержания мРНК тирозингидроксилазы было обнаружено не только в телах дофаминергических нейронов в черной субстанции, но и в нейронах стриатума. Это, вероятно, является показателем компенсаторной активации синтеза дофамина в недофаминергических нейронах стриатума, содержащих одиночные комплементарные ферменты синтеза дофамина. Как было показано ранее авторами проекта при изучении дофаминергической системы гипоталамуса, такого рода моноферментные нейроны, экспрессирующие только тирозингидроксилазу или только декарбоксилазу ароматических аминокислот (второй фермент синтеза дофамина), совместно синтезируют дофамин.
Помимо описанных компенсаторных механизмов, направленных на поддержание физиологически активной концентрации дофамина в межклеточном пространстве в стриатуме, нами обнаружены признаки и принципиально другого компенсаторного механизма – повышения чувствительности нейронов-мишеней к дофамину. Так, в стриатуме у мышей на модели ранней клинической стадии обнаружено увеличение экспрессии гена Д2 рецепторов на 20%.
В отличие от нигростриатной дофаминергической системы, в ряде других моноаминергических систем мозга (серотонинергическая и норадренергическая) у мышей на модели ранней клинической стадии, также как и на модели доклинической стадии, не было обнаружено изменений метаболизма моноаминов. Однако у мышей на модели ранней клинической стадии, в отличие от доклинической стадии, обнаружены изменения в метаболизме катехоламинов в надпочечниках – тенденции к увеличению содержания норадреналина, адреналина и дофамина. Вероятно, это связано с деградацией симпатической нервной системы и нарушением ее влияния на секрецию катехоламинов в надпочечниках.
Поиск изменений состава плазмы крови как потенциальных диагностических маркеров показал, что уровень L-ДОФА и ДОФУК на хронической модели ранней клинической стадии БП снижается в еще большей степени, чем на модели доклинической стадии. Эти данные, с одной стороны, подтверждают предположение о прогрессирующей деградации симпатической нервной системы при переходе от доклинической к клинической стадии БП, а с другой, косвенно свидетельствуют о том, что некоторые маркеры, выявленные у нелеченых больных на ранней стадии БП, могут служить также маркерами БП на доклинической стадии. В отличие от метаболитов катехоламинов, уровень норадреналина, дофамина и адреналина не изменялся в плазме крови на модели ранней клинической стадии, что согласуется с данными, полученными на нелеченых больных на ранней стадии БП. С другой стороны, отмеченное увеличение уровня адреналина на хронической модели доклинической стадии БП (см. выше), но не на ранней клинической стадии, можно рассматривать как специфический биомаркер доклинической стадии БП. Это, вероятно, будет относиться и к изменению содержания альфа-синуклеин в лимфоцитах.
Таким образом, работа по проекту, направленная на создание хронических экспериментальных моделей болезни Паркинсона, оценку молекулярных механизмов нейродегенерации и нейропластичности и поиск периферических биомаркеров на этих моделях, за отчетный период выполнена полностью.