Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка эпигенетических сигнатур для выявления колоректального рака на ранних стадиях

Номер контракта: 14.604.21.0102

Руководитель: Дегтярев Сергей Харитонович

Должность: заведующий отделом

Организация: Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Организация докладчика: Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
онкология, эпигенетическая диагностика, эпигенетические маркеры, маркеры метилирования днк, методы детекции метилированной днк

Цель проекта:
1. Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект. Онкологические заболевания являются глобальной проблемой мирового масштаба. Высокий уровень смертности в России от онкологических заболеваний обусловлен поздним выявлением патологии. В 60% случаев заболевание диагностируется на III-IV стадиях, когда лечить трудно, дорого, а зачастую и невозможно. Поэтому одной из важнейших проблем современной медицины является разработка эффективных диагностических методов, позволяющих выявлять заболевание на ранних стадиях. На сегодняшний день наиболее перспективным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга онкологических заболеваний представляется эпигенетическая диагностика, то есть идентификация болезни путем выявления эпигенетических маркеров. Одним из основных эпигенетических маркеров канцерогенеза является локальное метилирование сайтов PuCGPy регуляторных областях генов-онкосупрессоров. В настоящее время показано, что именно такое метилирование происходит на начальных этапах большей части спорадических форм рака, которые в среднем составляют более 90% всех случаев злокачественных новообразований. Маркеры метилирования ДНК детектируются значительно чаще других молекулярных онкомаркеров, таких как структурные повреждения генов, белковые и углеводные онкомаркеры. На сегодняшний день описаны наборы метилированных генов-онкосупрессоров, специфичных для большинства типов опухолей. Эти эпигенетические маркеры детектируются уже на ранних стадиях заболевания до проявления клинических признаков, причем показана возможность их выявления не только в биопсийном материале, но и в крови. Для колоректального рака по литературным данным описано более 100 генов, уровень экспрессии которых существенно снижается в процессе малигнизации путем метилирования их регуляторных участков. Задачей проекта является выбор подходящих эпигенетических маркеров с целью определения колоректального рака по анализу крови, а также разработка на их основе ПЦР-тест-системы нового поколения. Результаты проекта будут способствовать внедрению эпигенетических маркеров для диагностики и мониторинга онкопатологий в рутинную клиническую практику. 2. Формулировка целей реализуемого проекта. - Разработать маркеры и их диагностически значимые комбинации (сигнатуры), включающие эпигенетические онкомаркеры для диагностики колоректального рака на ранних стадиях. - Создать эпигенетическую тест-систему для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР-анализа и оценить ее чувствительность и специфичность на экспериментальном и клиническом материале.

Основные планируемые результаты проекта:
Краткое описание основных результатов и их основные характеристики.
В ходе выполнения проекта показано, что эпигенетическая характеризация ДНК имеет ряд преимуществ перед морфологическими, биохимическими, цитологическими и генетическими методами диагностики рака. Приведено обоснование использования периферической крови в качестве объекта исследования при определении сигнатур колоректального рака. Показано, что разработанный метод GLAD-ПЦР-анализа может быть применен для быстрого определения статуса метилирования генов-онкосупрессоров при анализе образцов ДНК из периферической крови (из смывов с клеток крови и из плазмы).
Проведен отбор кандидатных маркеров среди известных эпигенетических онкомаркеров колоректального рака. В результате выбраны 15 регуляторных участков генов-кандидатов, гиперметилированных при колоректальном раке.
Проведены подбор и оценка качества ферментных препаратов, которые будут использованы для анализа в образцах клинического материала и разработки тест-системы. Разработана методика определения чистоты ферментных препаратов ДНК-эндонуклеаз, включая MD-эндонуклеазу GlaI.
В ходе исследований по влиянию способов забора крови и вариантов предварительной обработки образцов биологического материала было установлено, что использование процедуры смыва связанных с клеточными поверхностями нуклеиновых кислот приводит 2-5-кратному увеличению выхода ДНК по сравнению с обычным способом выделения ДНК из плазмы крови. Препараты, полученные с помощью разработанного для целей проекта метода выделения ДНК, связанной с клеточными поверхностями, характеризуются более высокой концентрацией, чем препараты ДНК, полученные при использовании альтернативных методов выделения, и достаточной чистотой для проведения ПЦР-анализа. По результатам проведенного исследования разработана Методика забора и предварительной обработки биологических образцов.
Создана коллекция образцов биологического материала, полученного из периферической крови различных групп больных и здоровых доноров. В коллекции содержатся образцы ДНК, выделенной из смывов с клеток крови, из плазмы крови, а также образцы ДНК, выделенной из тканей оперированных больных с диагнозом «колоректальный рак».
Разработана методика выделения ДНК, пригодной для GLAD-ПЦР-анализа, из образцов биологического материала, учитывающая требования по стандартизации составов используемых реакционных смесей и условий выделения ДНК, доступность используемых реагентов и требования по воспроизводимости результатов при условии соблюдения всех параметров реакции, качества используемых реагентов и правил организации работ.
Методика создана на основе разработанного в данном проекте метода выделения ДНК, связанной с клетками крови, позволяющего в течение 1 дня провести выделение и получить высокоочищенный препарат ДНК, пригодный для GLAD-ПЦР-анализа.
Сконструированы и синтезированы в необходимых количествах специфичные праймеры, олигонуклеотидные адаптеры и TaqMan-зонды для тест-системы.
Проведен скрининг выбранных эпигенетических онкомаркеров на наличие метилирования, коррелирующего с колоректальным раком. Наиболее перспективными оказались 6 маркерных генов, выявившие от 80 до 100% исследованных образцов колоректального рака. В дальнейшем, в ходе анализа большего количества опухолевых образцов разного генеза, предполагается, что данный список генов будет уточняться и/или дополняться.
Основным результатом проекта будут разработанные сигнатуры, включающие эпигенетические онкомаркеры колоректального рака, и созданная эпигенетическая тест-система, предназначенная для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР-анализа. Будет проведена верификация сигнатур на препаратах ДНК не менее 200 пациентов с подтвержденным диагнозом и не менее 200 здоровых доноров. Также будет проведена оценка чувствительности и специфичности сигнатур.
Будет разработана технология получения эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на основе GLAD-ПЦР-анализа, изготовлен экспериментальный образец и проведены его исследовательские испытания
Будет разработана необходимая документация на тест-систему и выработаны рекомендации и предложения по использованию результатов проекта в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы.
Основным конечным продуктом проекта является тест-система для определения метилирования генов-онкомаркеров колоректального рака. Тест-система должна предусматривать определение не менее 5 маркеров (сигнатура), связанных с колоректальным раком, и отвечать следующим основным требованиям:
- минимальное количество анализируемой ДНК, достаточное для проведения одного анализа – 0,3 нг;
- чувствительность определения метилированных сайтов – не менее 80%;
- специфичность выявления метилированных сайтов – не менее 90%;
- вероятность достоверного отличия уровня метилирования маркера в раковых клетках;
- скорость диагностики метилирования – не менее 95%;
- количество анализируемых маркеров – не менее 5;
- минимальное количество сигналов с разных маркеров в сигнатуре, необходимых для постановки диагноза – не менее 2ж
- метод детекции - real-time.
2. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.
Результаты предлагаемого исследования направлены в первую очередь на получение принципиально новой продукции, аналогов которой нет ни в России, ни в мире. В настоящей работе впервые разрабатывается тест-система для определения метилирования ряда генов-онкомаркеров колоректального рака с помощью нового запатентованного метода GLAD-ПЦР-анализа (Патент РФ №2525710 от 15.05.2014). Для анализа используется ДНК, выделяемая из смывов с клеток периферической крови методом, также разработанным в данном проекте.
3. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Многочисленные исследования в области медицинской эпигеномики уже позволили разработать ряд способов эпигенетической ДНК-диагностики для некоторых онкологических заболеваний. Так, в компании Epigenomics AG (Германия) были разработаны тест-системы для диагностики колоректального рака на основе выявления специфического эпигенетического маркера mSEPT9 в периферической крови (Epi proColon) и диагностики рака легких на основе выявления эпигенетического маркера mSHOX2 в бронхиальном секрете (Epi proLung). Использование этих тестов позволяет выявлять заболевание на ранних стадиях, причем ограничить применение неприятной полуинвазивной процедуры (колоноскопии) только для пациентов с высоким риском развития онкопатологии толстого кишечника, а также повысить точность анализа при диагностике рака легких. Исследования в данной области, проводимые российскими учеными, также позволили разработать ряд методик эпигенетической ДНК-диагностики онкологических заболеваний, таких как рак предстательной железы, рак шейки и тела матки. Для детекции маркеров метилирования зарубежные производители, как правило, используют методы, основанные на бисульфитной конверсии цитозиновых оснований, которые, однако, имеют ряд существенных недостатков. Среди них 1) неполнота конверсии, что может приводить к ошибочным результатам анализа, а также 2) значительные потери ДНК на этапе конверсии; кроме того, 3) эти методы являются ресурсоемкими. Все это негативно сказывается на качестве и стоимости проводимой диагностики. Альтернативные методы, основанные на использовании метил-связывающих белков для изоляции метилированной ДНК и ее последующей амплификации (например, технология MethylMeter, разработанная специалистами американской компании «RiboMed»), позволяют достигать высоких показателей чувствительности/специфичности и используются производителями некоторых тест-систем (например, G-CIMP DecisionDX от «Castle Biosciences», США). Тем не менее, они остаются весьма трудоемкими, а для четкого количественного анализа результатов требуется сложное дорогостоящее оборудование. В результате, минимальная стоимость одного эпигенетического ДНК-теста составляет не менее 150 евро. Ферментативные методы, основанные на расщеплении ДНК метилчувствительными и/или метилзависимыми эндонуклеазами, являются гораздо более простыми и в то же время достаточно чувствительными. В частности, в ряде отечественных методик эпигенетической диагностики для детекции маркеров метилирования используется метил-чувствительная ПЦР, основанная на действии метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции. Однако данный подход не позволяет выявлять частично метилированную ДНК, тогда как именно такой паттерн метилирования CpG-островков характерен для самых ранних стадий канцерогенеза. Это накладывает значительные ограничения на чувствительность теста. Таким образом, использование новых методов и технологий детекции метилированной ДНК является перспективным направлением в разработке новых эпигенетических тест-систем для ДНК-диагностики онкопатологий.
В настоящей работе применяется новый запатентованный метод GLAD-ПЦР-анализа для определения тех сайтов функционального метилирования ДНК, которые являются специфичными маркерами колоректального рака. Внедрение метода GLAD-ПЦР-анализа позволит значительно увеличить чувствительность эпигенетической онкодиагностики, сократить время анализа и снизить его стоимость, что, несомненно, будет способствовать увеличению доли эпигенетического тестирования в общей структуре лабораторной онкодиагностики.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция).
Область применения полученных результатов охватывает не только создание эпигенетической тест-системы для ранней онкодиагностики, но и возможное использование методов получения ДНК в клинической и лабораторной практике, а также методики определения чистоты эндонуклеаз в молекулярно-биологических научных исследованиях. Метод GLAD-ПЦР-анализа может быть применен для быстрого определения статуса метилирования генов-онкосупрессоров при анализе образцов ДНК в эпигенетических исследованиях и разработках.
Основным потенциальным потребителем эпигенетических ПЦР-тест-систем для онкодиагностики нового поколения являются производители диагностикумов, которые получат возможность использовать научные результаты предлагаемого проекта для создания новых образцов продукции.
Результаты работ по проекту (в частности, методика выявления маркеров метилирования ДНК) могут быть использованы подразделениями научно-исследовательских институтов, занимающимися вопросами эпигенетики заболеваний, для улучшения технико-экономических характеристик существующих методов эпигенетической диагностики.
Конечными потребителями тест-систем выступают специализированые онкоцентры, а также диагностические лаборатории и диагностические центры общего профиля, как государственные, так и частные.
2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.
Результаты работы по проекту будут предназначены для создания ПЦР-тест-системы ранней эпигенетической онкодиагностики нового поколения и ее последующего внедрения в клиническую практику. Успешное внедрение полученных в работе результатов обеспечит создание инновационных тест-систем эпигенетической ДНК-диагностики, ориентированной на программы массового скрининга здоровья населения с целью выявления онкологических заболеваний на ранних стадиях, что способствует укреплению здоровья и повышению качества жизни граждан и в целом соответствует целям приоритетного национального проекта «Здоровье».
3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы.
Значимость работы обусловлена ожидаемыми социально-экономическими эффектами от коммерциализации разрабатываемой тест-системы, связанными с ранним выявлением рака, когда еще велика возможность успешного лечения. Для успешной коммерциализации разработки налажено эффективное взаимодействие Получателя субсидии с Индустриальным партнёром
На данном этапе проекта коммерциализация результатов не предусмотрена. Последующее развитие проекта предусматривает ОКР по созданию готовой тест-системы для использования в клинической и лабораторной практике с прогнозируемой потребностью рынка не менее 1 000 000 исследований в год.
4. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
Поскольку мировой рынок эпигенетической диагностики еще только формируется, передовые разработки и внедрение новых продуктов для эпигенетической диагностики необходимы российским компаниям-производителям, чтобы впоследствии занять прочные позиции на этом рынке и в России, и в мире.
Основные результаты, полученные в итоге выполнения проекта, относятся к критическим технологиям: геномные, протеомные и постгеномные технологии; технологии снижения потерь от социально-значимых заболеваний.
Согласно результатам исследований по прогнозированию развития научно-технологической сферы, заявленное исследование входит в научно-технологические Российские и мировые приоритеты.

Текущие результаты проекта:
Основные текущие результаты проекта.
1) Отобраны эпигенетические онкомаркеры колоректального рака, включающие регуляторные участки 15 генов (SEPT9, FBN1, RUNX3, GATA4, SND1, ADHFE1, TLX2, ITGA4, CNRIP1, RYR2, SOCS3, FLI1, UCHL1, ELMO1, ESR1), часто подвергающихся гиперметилированию при колоректальном раке, нуклеотидные последовательности которых соответствуют условиям проведения GLAD-ПЦР-анализа.
2) Проведены исследования влияния способов забора крови и вариантов предварительной обработки образцов биологического материала на определение метилирования ДНК. Установлено, что применение стерильных одноразовых вакуум-содержащих систем с антикоагулирующие веществами является лучшим способом забора крови. Использование процедуры смыва связанных с клеточными поверхностями нуклеиновых кислот приводит 2-5-кратному увеличению выхода ДНК по сравнению с обычным способом выделения ДНК из плазмы крови. Препараты, полученные с помощью разработанного в ходе ПНИ метода выделения ДНК, связанной с клеточными поверхностями, характеризуются более высокой концентрацией, чем препараты ДНК, полученные при использовании трех альтернативных методов выделения, и достаточной чистотой для проведения ПЦР-анализа. Разработана методика забора и предварительной обработки биологических образцов.
3) Разработана методика выделения ДНК, пригодной для GLAD-ПЦР-анализа, из образцов биологического материала, учитывающая требования по стандартизации составов используемых реакционных смесей и условий выделения ДНК, доступность используемых реагентов и требования по воспроизводимости результатов при условии соблюдения всех параметров реакции, качества используемых реагентов и правил организации работ.
4) Выполнен подбор и оценка качества ферментных препаратов для разработки тест-системы. Разработана методика определения чистоты ферментных препаратов для тест-системы, в т.ч. MD-эндонуклеазы GlaI.
5) Создана коллекция образцов биологического материала, полученного из плазмы периферической крови различных групп больных и здоровых доноров. Коллекция дополнена образцами ДНК, выделенной из смывов с клеток крови, а также образцами ДНК, выделенной из тканей оперированных больных с диагнозом «колоректальный рак». На настоящий момент в коллекцию входит:
–136 образцов ДНК, больных c диагнозом «колоректальный рак».
–136 образцов ДНК здоровых доноров.
–29 образцов ДНК из опухолевых тканей больных с диагнозом «колоректальный рак».
6) Разработаны и синтезированы специфичные праймеры, олигонуклеотидные адаптеры и TaqMan-зонды для тест-системы.
7) Проведен скрининг выбранных эпигенетических онкомаркеров на наличие метилирования, коррелирующего с колоректальным раком, в ходе которого выбраны наиболее перспективные гены, позволяющие выявить от 80 до 100% исследованных образцов колоректального рака.
8) Разработана технология получения эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на основе GLAD-ПЦР-анализа и подготовлен лабораторный регламент.
9) Изготовлен экспериментальный образец тест-системы и проводятся его испытания по разработанной Программе и методикам.
Полученные результаты полностью соответствуют требованиям ТЗ и позволяют продолжить выполнение проекта согласно календарному плану.