Регистрация / Вход
Прислать материал

Поиск белковых и гликановых онкомаркеров и их сигнатур в сыворотках крови больных онкологическими заболеваниями, с целью выявления новых диагностических маркеров колоректального рака.

Номер контракта: 14.604.21.0103

Руководитель: Рубина Алла Юрьевна

Должность: научный сотрудник

Организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
диагностические сигнатуры для обнаружения колоректального рака, специфические иммуноглобулины, онкомаркеры, аутоантитела, онкоассоциированные гликаны, онкогликобиология, гликочипы, колоректальный рак

Цель проекта:
1) Основной задачей проекта является выявление наиболее эффективных сигнатур онкоассоциированных серологических маркеров для ранней диагностики колоректального рака. 2) Основной целью выполнения работ является: - Выявить маркеры и их диагностически значимые комбинации (сигнатуры), включающие естественные антитела и гликопротеины для диагностики колоректального рака. - Разработать макет тест-системы на основе сигнатур и оценить его диагностическую чувствительность и специфичность. Колоректальный рак диагностируется более чем у 140000 человек ежегодно и вызывает около 50000 – 60000 смертей в год и занимает третье место по распространенности среди населения индустриальных стран. Это огромные цифры, если учесть, что заболевание является потенциально излечимым, если диагноз поставлен на ранней стадии. Ранняя диагностика, своевременное хирургическое вмешательство позволяют сохранить жизнь и здоровье пациента. Существует несколько методов для скрининга и диагностики колоректального рака. Они включают пальцевое исследование прямой кишки, анализ кала на кровь, фибросигмоидоскопия, колоноскопия, ирригоскопия. Вышеперечисленные инвазивные методы неприятны для пациента, поэтому больные, даже с ярко выраженной симптоматикой, пытаются отложить визит к врачу из-за возможных дискомфортных ощущений. В связи, с этим разработка неивазивных методов диагностики колоректального рака является актуальной проблемой. Главной проблемой молекулярной (in vitro) диагностики онкологических заболеваний является низкая специфичность известных серологических онкомаркеров. Поэтому для более точной диагностики онкозаболеваний, как правило, используют комбинации из нескольких (до десяти, а иногда и более) независимых онкомаркеров. Такие комбинации онкомаркеров называют диагностическими сигнатурами. Выявление диагностических сигнатур является мультиплексной задачей, поскольку для определения N маркеров требуется проведение N специфических тестов. Инструментом для проведения мультиплексного анализа образца одновременно по нескольким параметрам является биологический микрочип. Большая часть современных исследований описывает 2D-микрочипы, т.е. чипы, в которых молекулярный зонд (пептид, белок или гликан) иммобилизован непосредственно на поверхности носителя, в качестве которого выступают пластик, мембрана или химически модифицированное стекло. Описаны 2D белковые микрочипы различной конструкции для определения нескольких онкологических маркеров в сыворотке крови пациента. Сыворотки пациентов с колоректальным раком тестировали на С12 биочипе (определение 12-ти белковых онкомаркеров), однако полученная сигнатура белковых онкомаркеров оказалась неэффективной для выявления ранних форм колоректального рака. Одновременно с развитием технологии белковых микрочипов, начала развиваться технология гликочипов. Гликочипы состоят из ячеек с иммобилизованными гликанами различной структуры и используются для обнаружения анти-гликановых антител в сыворотке крови пациента. Первая работа по поиску эффективных гликановых сигнатур для диагностики рака яичника была опубликована в 2010г., для диагностики колоректального рака такие сигнатуры еще не выявлены. Использование антигликановых антител в качестве маркеров онкологических заболеваний – актуальное направление молекулярной диагностики. Число этих антител велико, а выявляются они одними и теми же реагентами в одинаковых условиях, вследствие чего применение антительных сигнатур становится практичным. В случае колоректального рака происходит сверхэкспрессия гликопротеиновых онкомаркеров, которым свойственно аберрантное гликозилирование. Антитела к онкоассоциированным гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака. Однако до сих пор не разработан метод, позволяющий проводить комплексный анализ как белковых серологических онкомаркеров, так и антител к гликанам. Таким образом, поиск и отбор специфичных молекулярных маркеров КРР остается актуальной научной задачей. В представленном проекте поиск белковых и гликановых онкомаркеров и их сигнатур в сыворотках крови больных колоректальным раком осуществляется методом иммуноанализа на биологическом микрочипе. Разрабатываемый инструмент позволит в одном анализе определить профиль не менее шести белковых онкомаркеров, в том числе АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB 4, CA 242 и гликановую сигнатуру. Для определения гликановой сигнатуры в ячейках биочипа иммобилизованы 40 онкоассоциированных гликанов, включая: SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc. Мы рассчитываем, что одновременное использование белковой и гликановой сигнатур позволит выявлять колоректальный рак на ранней стадии надежнее, чем обычно используемая пара онкомаркеров CEA и CA19.9. Для выявления новых диагностических сигнатур будет использована технология гидрогелевых биочипов.

Основные планируемые результаты проекта:
При выполнении проекта будут выявлены новые эффективные серологические маркеры, в том числе онкоассоциированные гликаны и их комбинации (сигнатуры) для раннего обнаружения колоректального рака, и создан задел для дальнейшего перехода к производству диагностической тест-системы на основе белковых и гликановых сигнатур для обнаружения ранних форм колоректального рака.
-Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ по этапам выполнения работ в соответствии с ГОСТ 7.32-2001, отражающие результаты работ.
-Макет тест-системы на основе сигнатур, включающих естественные антитела и белковые маркеры для диагностики колоректального рака. Разрабатываемая тест-система должна предусматривать определение профилей белковых онкомаркеров (не менее шести, в том числе АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB4, CА 242) и гликановой сигнатуры (не менее 20-ти онкоассоциированных гликанов, включая: SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc) в одном микрообъеме сыворотки/плазмы крови на микрочипе. Тест-система должна обеспечивать: чувствительность: 90%, не менее; специфичность: 80%, не менее; общее время выполнения анализа – 20 часов, не более; объем сыворотки/плазмы крови человека, достаточный для проведения одного анализа 100 мкл.
-Эскизная конструкторская документация на макет тест-системы на основе сигнатур.
-Проект инструкции по применению тест-системы и Протокол проведения анализа.
-Лабораторный технологический регламент изготовления тест-системы на основе сигнатур с учетом требований ОСТ 64-02-003-2002.
-По лабораторному технологическому регламенту должны быть изготовлены макеты тест-системы (не менее 500 шт. биологических микрочипов) и проведены исследовательские испытания макета тест-системы по разработанной Программе и методикам исследовательских испытаний.
-Рекомендации по использованию результатов проведенных ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
-Описание оценки эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно- техническим уровнем
-Технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов.
-Техническое задание на проведение ОКР по теме «Разработка диагностической тест-системы на основе белковых и гликановых сигнатур для обнаружения ранних форм колоректального рака».
-Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера – организации реального сектора экономики.
-Отчеты о патентных исследованиях в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
-Две патентные заявки.
-Пять публикации по результатам проекта.
-Техническое задание на проведение ОКР по теме: «Разработка диагностической тест-системы на основе белковых и гликановых сигнатур для обнаружения ранних форм колоректального рака».

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения проекта будет разработан макет тест-системы "КР-БИОЧИП" на основе выбранных сигнатур для in vitro диагностики ранних форм колоректального рака. По окончании выполнения проекта будут обнаружены новые эффективные серологические маркеры, в том числе онкоассоциированные гликаны и их комбинации (сигнатуры) для раннего обнаружения колоректального рака, и создан задел для дальнейшего перехода к производству диагностической тест-системы на основе белковых и гликановых сигнатур. Разрабатываемая тест-система будет обнаруживать колоректальный рак на ранних стадиях по определению профилей белковых онкомаркеров (не менее шести, в том числе АФП, ХГЧ, СЕА, СА 19-9, SPB 3, SPB4, CА 242) и гликановой сигнатуры (не менее 20-ти онкоассоциированных гликанов, включая: SiaTn, Tn, TF, LeC, LeY, SiaLeA, Manβ1-4GlcNAc) в одном микрообъеме сыворотки/плазмы крови на микрочипе. Тест-система должна обеспечивать: чувствительность: 90%, не менее; специфичность: 80%, не менее; общее время выполнения анализа – 20 часов, не более; объем сыворотки/плазмы крови человека, достаточный для проведения одного анализа 100 мкл.
Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.
Несмотря на большое разнообразие молекулярных подходов к скринингу колоректального рака (КРР), в настоящее время все еще существует необходимость в методе, обладающим высоким диагностическим потенциалом для повышения эффективности скрининга/диагностики КРР. В настоящее время, для диагностики КРР, определяют концентрацию двух онкомаркеров: карциноэмбрионального антигена (РЭА) и карбогидратного антигена CA 19-9 в сыворотке крови пациента методом иммуноферментного анализа. В начале 2000-х обнаружили, что выявление антител к гликановым структурам при онкозаболеваниях имеет высокую клиническую значимость и открывает новые возможности диагностического сопровождения процесса онкотерапии. Это связано с тем, что антитела к гликанам обнаруживаются в сыворотке крови на ранних стадиях рака. Однако до сих пор не разработан метод, позволяющий проводить комплексный анализ как белковых серологических онкомаркеров, так и антител к гликанам. Таким образом, поиск и отбор специфичных молекулярных маркеров КРР остается актуальной научной задачей.
Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов диагносткик КРР являются их миниатюризация, повышение чувствительностии и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа диагностических сигнатур. В настоящее время задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов. Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов. Важно то, что только технология 3D биочипов, разработанная в ИМБ РАН, уникальна и позволяет в одном диагностикуме использовать элементы с иммобилизованными антителами к онкомаркерам, антителами к иммуноглобулинам человека и иммобилизованными гликанами. Структура гидрогеля позволяет полностью сохранять биологическую активность молекулярных зондов, что особенно важно для белков, которые подвержены денатурации. Высокое и контролируемое качество биочипов при производстве, контроль диаметра ячеек, позволяет получать высоко воспроизводимые результаты иммунофлуоресцентного анализа, что, несомненно, подтверждает высокий технологический уровень заявленного исследования.
Выполняемое исследование можно отнести к прорывным мировым исследованиям в области диагностики колоректального рака. Например, на выставке Medica 2015 (18 ноября 2015г, Дюссельдорф, Германия) будет представлен метод диагностики колоректального рака, основанный на ИФА анализе антител к четырем онкоассоциированным гликанам, определении иммуноглобулина А, гемоглобина в содержимом слизистой оболочки кишечника (OriCol Кембридж, Англия).
В нашей работе скрининг/диагностика ранних форм КРР будет основана на определении белковых (не менее 6 онкомаркеров) и гликановых сигнатур (не менее 20) на биологическом микрочипе, предоставляя возможность персоналу работать с сывороткой крови пациента.
Пути и способы достижения заявленных результатов:
Основные пути создания тест-системы и доведения до потребителя ожидаемых результатов следующие:
1.Подготовка детального технического задания для опытно-конструкторской разработки тест-системы, в которой должны принять участие специалисты ИМБ РАН и Индустриального партнера ООО «БИОЧИП-ИМБ». В этой работе так же могут принимать участие специалисты профильных медицинских учреждений.
2.Проведение ОКР, в ходе которой на основе полученного макета тест-системы будет создан опытный образец тест-системы.
3.Проведение испытаний опытного образца тест-системы на базе профильных медицинских учреждений,среди которых в первую очередь следует указать Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского", Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова.
4.На основе результатов проведенных испытаний с участием Индустриального партнера будет получено разрешение Росздравнадзора на использование разработанной тест-системы в качестве медицинского изделия для проведения диагностики в медицинских учреждениях.
5.Индустриальным партнером будет проведено детальное изучение рынка сбыта разработанной тест- системы и выполнены работы по маркетингу.
6.Организация производства тест-систем совместно с Индустриальным партнером и формирование рынка для выпускаемой продукции.
7.Проведение серии семинаров и практических занятий для персонала пользователей из числа сотрудников профильных медицинских учреждений и коммерческих диагностических центров.
8.Организация широкого сотрудничества с профильными медицинскими учреждениями Минздравсоцразвития для дальнейшего развития и совершенствования тест-системы.
Необходимо также отметить, что Индустриальный партнёр - общество с ограниченной ответственностью «БИОЧИП-ИМБ», было организовано в ноябре 2009 года в целях вовлечения в хозяйственный оборот результатов интеллектуальной деятельности единственного учредителя - ИМБ РАН (в рамках Федерального закона N 217-ФЗ от 02.08.2009 г).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результатом выполнения проекта является макет тест-системы "КР- БИОЧИП" на основе сигнатур для in vitro диагностики ранних форм колоректального рака. По окончании выполнения проекта будут обнаружены новые эффективные серологические маркеры, в том числе онкоассоциированные гликаны и их комбинации (сигнатуры) для раннего обнаружения колоректального рака, и создан задел для дальнейшего перехода к производству диагностической тест-системы на основе белковых и гликановых сигнатур.
На заключительном этапе работ по проекту Индустриальный партнер ИМБ РАН ООО «БИОЧИП- ИМБ» разработает технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей компании. Компания ООО «БИОЧИП -ИМБ» компания с большим опытом коммерциализации тест-систем на основе биологических микрочипов для диагностики социально- значимых заболеваний на территории стран бывшего СССР и рынках ЕС. Индустриальный партнер обязался лицензировать, полученные в ходе выполнения ПНИ РИД и участие в создании на основе макета разрабатываемой тест-системы коммерческого продукта. Результаты ПНИ будут востребованы в работе профильных медицинских учреждений, лабораториях научно-исследовательских институтов РАМН, работающих в области онкологии. Конечными потребителями продукта могут являться медицинские учреждения Росздрава и РАМН, такие, как Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского", Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова, РОНЦ им. Н.Н. Блохина.
Ожидаемый экономический эффект: Ежегодно, государства всего мира тратят огромные бюджетные средства на лечение последствий колоректального рака. Например, затраты на лечение одного больного с колоректальным раком в России составляют более 1 млн. руб. [http://con-med.ru/magazines/contemporary/contemporary-04 2013/farmakoekonomicheskaya_otsenka_primeneniya_targetnykh_preparatov_v_lechenii_metastaticheskogo_kolore/]. По данным РОНЦ им. Н.Н Блохина, колоректальный рак занимает второе место по распространённости среди онкологических заболеваний в России. В 2009 году в нашей стране зарегистрировано более 50 000 случаев колоректального рака. В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований колоректальный рак также занимает второе место (после рака лёгкого). По аналитическим данным [http://www.hse.ru, Нишевой обзор рынка], иммунодиагностика занимает в общей сложности около 8% от общего числа анализов (280 миллионов анализов в год). Если принять, что диагностика колоректального рака при помощи иммуноферментного анализа занимает примерно 1% от всех иммунологических анализов (цифра занижена), то можно рассчитать, что в России ежегодно проводится более двух миллионов анализов (2 млн. анализов в год). Известно, что российский рынок Лабораторной диагностики является «догоняющим» по отношению к развитым странам и пока не достиг пределов насыщения, по достижении которых будет расти с темпом, аналогичным мировому рынку.
Предположим, что определение колоректального рака при помощи белковых и гликановых диагностический сигнатур на биочиповой тест-системе будет составлять 5% от имеющейся потребности в диагностике колоректального рака (100 тыс. анализов в год). В этом случае, при стоимости одного анализа для диагностики колоректального рака на биочиповой тест-системе равной 1000 руб., объем продаж составит 100 млн. руб./год. Обычная стоимость определение двух онкомаркеров в сыворотке крови
(определение уровней СЕА и СА 19-9), используемая врачом для подтверждения диагноза колоректальный рак более 1200 руб. (данные сайта www. in vitro.ru).
Помимо коммерческого эффекта, внедрение разрабатываемой тест-системы для диагностики колоректального рака в народное хозяйство даст следующие выгоды, трудно поддающиеся финансовым расчетам: улучшение здоровья населения за счет своевременного скрининга и выполнения профилактических мероприятий для каждого данного пациента; уменьшение дней неработоспособности за счет правильной постановки диагноза и оперативного хирургического вмешательства; увеличение продолжительности жизни пациентов, страдающих колоректальным раком за счет исключения развития солидной опухоли. Наличие интеллектуальной собственности, разработанной в России и принадлежащей разработчику отечественных биочипов (ИМБ РАН), позволит быстро наладить производство патентно-чистой продукции, которая, безусловно, будет влиять на рынок ценообразования соответствующих услуг в России, и может способствовать экспорту в другие страны.

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор научно-технической литературы. Проведены патентные исследования. Осуществлен выбор списка маркеров для количественного анализа в образцах клинического материала и формирования сигнатур. Для формирования сигнатур были выбраны: РЭА, СА 19-9, СА 15-3, СА 125, SPB 3, SPB 4, PSA, ХГЧ, АФП, СА 242, СА72-4 и 47 гликанов. Исследованы сигнатуры, специфичные к различным онкологическим заболеваниям. Проведена экспериментальная проверка метода одновременного анализа нескольких онкомаркеров в клиническом образце на микрочипах, доказана диагностическая эффективность одновременного анализа нескольких белковых онкомаркеров (ПСАобщ, ПСАсвоб, АФП, ХГЧ, РЭА, СА 125, СА 15-3, СА 19-9) в клиническом образце на микрочипах. Разработан метод иммобилизации белков и гликанов в ячейках биочипа. На микрочипах проанализирована панель моноклональных антител против антигенов SPB3 и SPB4, подобраны пары антител для количественного определения онкомаркеров SPB3 и SPB4 в растворе. Пара антител для SPB3: иммобилизованны антитела C5/ конъюгат верхних антител SCC 107-Су5. Для SPB4 иммобилизованны антитела A11/ конъюгат верхних антител SCC 107-Су5. По результатам работ опубликована статья. Выбран и экспериментально проверен метод проведения одновременного анализа аутоантител к различным гликанам в сыворотке крови человека. На примере анализа трисахаридов групп крови было показано преимущество проведения иммунофлуоресцентного анализа аутоантител к гликанам на биологических микрочипах по сравнению с иммунологическими планшетами. Осуществлен подбор концентраций молекулярных зондов для разработки макета тест-системы. Разработана эскизная конструкторская документация на макет тест-системы. По эскизной конструкторской документации были изготовлены макеты тест-системы на основе биочипов. Осуществлена экспериментальная проверка характеристик макета тест-системы с использованием трисахаридов групп крови. Нижний предел детекции (аналитическая чувствительность) по антителам А 16 к трисахариду А - 4 нг/мл; экспериментально определенный титр антител к трисахариду В для сыворотки крови здорового донора со II группой крови составил 1: 1200, коэффициент вариации- 10%; воспроизводимость иммуноанализа составила 90%. Клинические характеристики макета тест-системы были экспериментально проверены на сыворотках крови пациентов с колоректальным раком (33 сыворот-ки), пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (27 сывороток) и здоровых доноров (69 сывороток). Чувствительность макета тест-системы по одновременному иммунофлуоресцентному выявлению концентрации шести белковых онкомаркеров (СЕА, СА 19-9, СА 125, СА 15-3, HCG, AFP) и уровня антител к четырем онкоассоциированным гликанам (Tn, TF, SiaLeA, Manβ1-4ClcNAc) составила 48,5%, что почти в два раза выше чувствительности эталонного метода определения коло-ректального по концентрации СЕА и СА 19-9 (21,2%). Доля верно определенных диагнозов возросла с 79,8% до 83,7%. По результатам работ написана статья. Получены конъюгаты антител против человеческих иммуноглобулинов различных классов с флуоресцентными красителями и биотином, разработана проявляющая система на их основе.
Изготовлены макеты тест-системы (300 биочипов и проявляющая система). Для разработки лабораторного регламента изготовления тест-системы исследовано влияние следующих параметров: температура и влажность в камере робота при нанесении биочипов (оптимально 22 градуса С, влажность 30%); влияние состава блокирующего раствора перед проведением иммуноанализа на биочипах (2% БСА, 5% сахароза, PBS, 1% PVA (выбран 1% PVA)); исследование температуры хранения биочипов (оптимально 4÷10 градуса С). С использованием макетов тест- системы исследованы сыворотки крови пациентов методом прямого- и сэндвич- иммуноанализа. Выбран сэндвич-метод. На макетах тест-системы проведено изучение взаимодействия антител с гликанами в 120 сыворотках здоровых доноров. Написана патентная заявка. Разрабатывается протокол проведения иммунофлуоресцентного анализа и проект инструкции по применению тест-системы. Выбран состав инкубационной среды (разведение сыворотки 1:5 PVP-PVA). Качество и гомогенность препаратов антител проверена ВЭЖХ. Осуществлена проверка специфичности антител в мультиплексном иммуноанализе на биочипе.