Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов получения модифицированных высокоаффинных ДНК-аптамеров и создание на их основе нового эффективного средства для противоопухолевой терапии

Номер контракта: 14.604.21.0110

Руководитель: Фролова Елена Ивановна

Должность: заведущий Группой экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
днк- аптамеры, биосенсоры, высокоаффиинные биополимеры, модификация оснований, молекулярные и клеточные мишени.

Цель проекта:
Проект позволит разработать новый функциональный инструментарий, с помощью которого будет возможно быстро и эффективно получать олигонуклеотидные соединения, сильно и избирательно связывающие наиболее востребованные биологические мишени – высокогликозилированные секретируемые белки и белки, расположенные на поверхности клеток. Вторая цель проекта - создание нового терапевтического средства – противоопухолевого ДНК-аптамера на основе модифицированных нуклеотидов, нацеленного на высокогликозилированный рецептор, присутствующий на поверхности опухолевых клеток. Терапевтическое средство должно обладать большей эффективностью, за счет большей аффинности и специфичности в отношении своей мишени, чем разрабатываемые аналоги - моноклональные, а также большей биодоступностью и равной или превосходящей аналоги стабильностью в биологических жидкостях.

Основные планируемые результаты проекта:
Разработка и испытание новой технологии получения модифицированных нуклеозидтрифосфатов с присоединенными к гетероциклическим основаниям функциональными группами, обладающих высокой аффинностью к полисахаридам, в том числе, составляющим гликозидную часть белка. Определение структуры функциональной группы и длины линкера, соединяющего ее с нуклеозидом, обеспечивающие максимальное сродство модифицированного нуклеозида к полисахаридам с сохранением его способности являться субстратом для термостабильной ДНК-полимеразы. В совокупности эти два результата составят основу нового мощного инструмента для получения высокоаффинных амплифицируемых лигандов, обладающих избирательным сродством к гликозилированным мишеням, в частности, секретируемым белкам – гормонам и цитокинам, а также поверхностным белкам-рецепторам. Эти группы белков наиболее часто выступают в роли мишеней при поиске новых лекарственных средств для терапии метаболических расстройств, онкопатологий, моно-и полигенных заболеваний.
Также в результате выполнения предлагаемого проекта будет создано новое эффективное средство для терапии широкого спектра злокачественных заболеваний – блокирующий ДНК-аптамер против поверхностного рецептора CD47. Полученный терапевтический аптамер будет обладать высокой стабильностью в биологических жидкостях, не меньшей или превосходящей таковую у моноклональных антител, более высокой афинностью к CD47 и, как следствие, меньшей эффективной дозировкой при системном применении, а также существенно более высокой биодоступностью вследствие примерно 50-кратной разницы в размерах молекул (~3 kDa для 60-нуклеотидного ДНК-аптамера в сравнении с 150 kDa для моноклонального антитела).
Еще однин результат проекта - получение систематических сведений о влиянии структуры функциональных групп, содержащих ароматические бороновые кислоты, и длины линкеров на способность этих функциональных групп эффективно связывать полисахариды в составе гликозилированных белков, находясь в составе модифицированного ДНК-аптамера и при этом не интерферируя с ферментативной амплификацией самого аптамера. Такие сведения облегчат дальнейшую разработку иных модифицированных нулкеозидтрифосфатов, обладающих избирательным сродством к другим классам мишеней.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Результатом проекта, обладающим наибольшей степенью готовности к фактическому применению, а также выраженным положительным социально-экономическим эффектом является терапевтический противоопухолевый ДНК-аптамер против рецептора CD47.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Предполагается, что анти-CD47-терапия будет обладать достоверной эффективностью как в составе монотерапии, что подтверждается в ходе экспериментов на мышиных моделях с использованием менее эффективных, чем ДНК-аптамеры блокирующих агентов – моноклональных антител, так и в составе комплексной химиотерапии в роли адъювантного средства. В этом случае ожидается возникновение синергического эффекта от применения химических агентов – цитостатиков, непосредственно угнетающих пролиферацию опухолевых клеток и анти-CD47-препаратов, позволяющих иммунной системе пациента эффективно атаковать опухолевые клетки. Таким образом, после проведения необходимых клинических испытаний терапевтический аптамер может быть введен в клиническую практику непосредственно в составе уже существующей комплексной химиотерапии. Одновременно с этим терапевтический ДНК-аптамер за счет своей более высокой биодоступности, меньшей иммуногенности и ожидаемого более высокого сродства к белку-мишени будет обладать рядом преимуществ по сравнению с функциональными аналогами – моноклональными антителами, которые разрабатываются в настоящее время за рубежом. Другим важным конкурентным преимуществом терапевтического аптамера является существенно более низкая стоимость производства и высокая стабильность в широком диапазоне температур. Такие характеристики дополнительно облегчат внедрение нового терапевтического средства в медицинскую практику и обеспечат возможности для его максимально широкого применения.
Практические сведения о влиянии функциональных групп и соединяющих их линкеров на свойства модифицированных нуклеозидтрифосфатов и эффективность модифицированных ДНК-аптамеров будут опубликованы и востребованы в ходе разработки новых модификаций нуклеозидтрифосфатов для использования в составе амплифицируемых аффинных реагентов, обладающих повышенным сродством к специфическим группам мишеней как организацией-индустриальным партнером, так и другими научными и производственными коллективами.

Текущие результаты проекта:
Была получена серия модифицированных нуклеотидтрифосфатов, содержащих присоедиенные к азотистым основаниям бороновые функциональные группировки, различающиеся по заряду и длине соединяющего линкера. После проведения испытаний были отобраны варианты, сочетающие высокую аффинность к полисахаридам с удовлетворительной способностью служить субстратом для термостабильных ДНК-полимераз.
Был создан экспрессирующий вектор и линия продуцент для получения рекомбинантного внеклеточного фрагмента рецептора CD47, проведена очистка рекомбинантного белка, который был затем использован для постановки селекции на аптамерных библиотеках, содержащих модифицированные нуклеотиды.
После проведения селекции были отобраны наиболее аффинные варианты аптамеров, как из модифицированных, так и из природной библиотек, после чего при помощи иммунологического теста определено, что два модифицированных варианта обладают большей аффинностью к мишени, чем наилучший немодифицированный. Проводятся работы по определению эффективности действия отобранных аптамеров на прерывание взаимодействия между CD47 и его лигандом SIRPa.