Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка прототипов генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций и методов их введения в клетки

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
митохондрии, митохондриальная миопатия с молочно-кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (melas), миоклональная эпилепсия с синдромом рваных красных волокон (merrf), репликон, reca, yarrowia lipolytica

Цель проекта:
Задачей данного проекта является разработка структуры генетической конструкции на основе природной митохондриальной ДНК человека, реплицирующейся в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica для коррекции митохондриальных дисфункций человека: митохондриальная миопатия с молочно-кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS) и миоклональная эпилепсия с синдромом рваных красных волокон (MERRF). В связи с реализацией данного проекта необходимо разработать метод доставки генетической конструкции в митохондрии при помощи использования гомологичной рекомбинации с целью дальнейшей коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. Используя оптимизированный в ходе исследований метод, создать генетическую конструкцию,предназначенную для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF с помощью новой клеточной модели на основе дрожжей Yarrowia lipolytica. Кроме того, для успешного выполнения проекта необходимо разработать методику оценки эффективности действия разработанной генетической конструкции.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения данного проекта должны быть получены следующие практичесике и экспериментальные результаты:
1) Обзор и анализ современной научно-технической, методической литературы исследуемой тематике.
2) Обоснование выбора оптимального варианта возможных решений исследуемой проблемы с учетом результатов исследований, проводившихся по аналогичной тематике.
3)Проведение сравнительной оценки эффективности возможных направлений исследований, с последующим анализом возможных механизмов доставки разрабатываемой генетической конструкции в митохондрии, теоретическое обоснование структуры предлагаемой к разработке генетической конструкции для практического решения задач по коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.
4) Разработка конструкции для введения в клетки Y. lipolytica гена белка RecA бактериального происхождения, транскрипт которого содержит адресные последовательности митохондриальной локализации (SOD-5’UTR и SOD-3’UTR). Написание рекомендаций и предложений по использованию полученных результатов.
5) Разработка лабораторного регламента получения генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF
6) Создание метода доставки генетической конструкции в митохондрии; а также методики оценки эффективности доставки генетической
конструкции в митохондрии.
7) Разработка и оптимизация методики оценки эффективности действия генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF;
8) Наработка экспериментальных образцов генетической конструкции, способной импортироваться в митохондрии и супрессировать мутации 3243A→G и 8344A→G в митохондриальном геноме человека.
9) Создание технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации препарата конструкции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики.
Проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Разработка технологии генотерапии митохондриальных расстройств с применением полноразмерной хромосомы человека, клонированной в клетках дрожжей».

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Актуальность работы обусловлена тем, что ни в одной из опубликованных печатных работ, включая патентные заявки, не предложено способов направленного воздействия на митохондриальный геном человека. Таким образом, этиотропные средства лечения митохондриальных болезней человека отсутствуют. Все существующие и преспективные средства лечения этих болезней основаны на купировании последствий митохондриальной недостаточности. Разработка средств направленной коррекции генома митохондрий создает принципиально новые возможности для практической медицины. Исполнителем проекта предложен и апробирован полностью оригинальный подход к восстановлению интактности генома митохондрий. Новая система позволит обеспечить лечение наиболее тяжелых распространенных митохондриальных болезней человека MELAS и MERFF, нарушающих функциональность генов митохондриальных Lys- Leu-специфичных рРНК.
Разработка является абсолютно оригинальной и требует последовательного решения двух фундаментальных задач клеточной инженерии:
Создание линий дрожжей, несущих систему гомологичной рекомбинации в митохондриях;
Разработка системы межвидового переноса митохондриальных геномов: создание искусственного ДНК-вектора на основе репликона митохондриального генома человека.
Генетическая конструкция, полученная в результате выполнения данного проекта, должна быть разработана на основе природного репликона митохондриальной ДНК человека.
Генетическая конструкция должна корректировать митохондриальную дисфункцию по следующему механизму:
введение полноразмерного митохондриального генома пациента в клетки дрожжей Yarrowia lipolytica методом замещения собственной дефектной хромосомы митохондрий дрожжей;
коррекция полноразмерного митохондриального генома пациента с использованием искусственных фрагментов ДНК и искусственно введенной в клетки дрожжей системы гомологичной рекомбинации (на основе бактериального белка RecA);
препаративное выделение скорректированного митохондриального генома из клеток Yarrowia lipolytica и введение его в мезенхимальные стромальные клетки пациента;
коррекция митохондриальных дисфункций путем введения пациенту собственных мезенхимальных стромальных клеток с восстановленным митохондриальным геномом.
Исполнителями данного проекта предложен и апробирован полностью оригинальный подход к восстановлению интактности генома митохондрий:
разработка системы искусственного привнесения в митоходрии дрожжей Yarrowia lipolytica системы гомологичной рекомбинации бактриального происхождения;
отработка методики введения и поддержания (в условиях селективного давления) нативного митохондриального генома человека в митохондриях клеток Y. lipolytica. Система селекции компенсаторных замен в искусственно поддерживаемом в дрожжах митохондриальном геноме человека основана на функциональной эквивалетности генов рРНК Y. lipolytica и человека и том факте, что наиболее распространенные мутации, лежащие в основе митохондриальных синдромов MELAS и MERFF, нарушают функциональность генов митохондриальных Lys- Leu-специфичных рРНК.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Область применения
Медицина, биотехнология, биоинженерия, фундаментальные исследования.

Полученные в рамках отчетного (второго) этапа результаты ПНИ закладывают основу для продолжения работ, предусмотренных Соглашением о предоставлении субсидии, направленных на разработку средств генотерапии митохондриальных болезней человека, в частности, создания системы направленной модификации митохондриального генома человека, реплицирующегося в митохондриях Y. lipolytica. Полученные конструкции могут быть использованы при создании новых технологий биоинженерии, позволяющих конструировать рекомбинантные продуценты биоактивных белков с митохондриальной локализацией продукта.
Оценка значимости работы
Ни один из исследованных видов эукариот не обладает системой гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Предложена интегративная генетическая конструкция pQ-SRUS, предназначенная для введения в клетки экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica гена RecA из Bacillus subtilis. Адресация рекомбинантного белка RecA в митохондрии обеспечивается за счет лидерных последовательностей мРНК гена SOD2 (5’-UTR и 3’-UTR), обладающих сродством к внешней поверхности митохондрий, и обеспечивающих котрансляционный транспорт RecA внутрь митохондрий. Штамм Y. lipolytica, несущий конструкцию pQ-SRUS, обладает уникальной для живых объектов способностью к интеграции ДНК-конструкций в митохондриальный геном, что было показано с применением тестерной конструкции pQ-NIHN, предназначенной для введения гена EYFP в область инициации трансляции митохондриального гена Y. lipolytica ND1.
Прогноз влияния полученных результатов
Ожидается, в срок 2 года с момента окончания Развитие ПНИ в рамках проекта будут проведены доклинические испытания нового средства генотерапии митохондриальных болезней человека. Использование новой системы для адресации рекомбинантых белков в митохондрии может быть использовано для создания продуцентов практических важных продуктов, неустойчивых в цитоплазме и секреторной системе дрожжей, непосредственно в ходе ПНИ или немедленно после их завершения.

Текущие результаты проекта:
Работа по второму отчетному периоду выполнения проекта включала теоретические и экспериментальные исследования в области создания средств коррекции дефектов митохондриального генома человека. В результате были получены следующие основные результаты:

Получен штамм Y. lipolytica, продуцирующий белок RecA бактериального происхождения с митохондриальной локализацией.
Выполнена оценка общего уровня продукции белка RecA в рекомбинантных клетках Y. lipolytica.
Изучен уровень накопления белка RecA в митохондриях рекомбинантных клеток Y. lipolytica.
Разработан Лабораторный регламент получения тест-системы для количественной оценки доли трансформантов, несущих вставку в
митохондриальный геном на принципе метагеномного анализа.
Разработана тест-система для количественной оценки доли трансформантов, несущих вставку в митохондриальный геном на принципе
метагеномного анализа.
Проведены работы, направленные на освещение и популяризацию промежуточных результатов ПНИ; опубликована одна статья, две находятся в печати, участвовали в двух конференциях, где выступили с изложением результатов, полученных в результате выполнения проекта.
Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа, включая внебюджетные средства исполнителя и индустриального партнера.