Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций

Номер контракта: 14.604.21.0113

Руководитель: Каменский Петр Андреевич

Должность: Ведущий научный сотрудник кафедры молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
митохондрии, митохондриальный геном, гетероплазмия, митохондриальные болезни, импорт нуклеиновых кислот в митохондрии, генная терапия

Цель проекта:
1. Разработка структуры генетической конструкции на основе нуклеиновых кислот для коррекции митохондриальной дисфункции, вызываемой мутациями в митохондриальном геноме. 2. Разработка метода доставки генетической конструкции в митохондрии при помощи использования белков-переносчиков или естественной системы транспорта нуклеиновых кислот в митохондрии с целью дальнейшей коррекции митохондриальной дисфункции. 3. Разработка методики оценки эффективности действия разработанной генетической конструкции.

Основные планируемые результаты проекта:
В 2016 году мы планируем разработать генетические конструкции для коррекции мутаций в митохондриальном геноме и на их основе предложить генно-терапевтическое решение для лечения нейродегенеративных заболеваний человека, в настоящее время неизлечимых, таких как синдромы MERRF, MELAS, KSS и пр.
Данный проект относится к разряду поисковых научных исследований, результаты которых могут оказать решающее значение на развитие науки и технологии.

Актуальность решаемых задач в настоящее время достаточно высока, так как они находится на стыке молекулярной биологии, биотехнологии, генетики, медицины и ветеринарии и предполагают получить положительные результаты в области лечения митохондриальных болезней. Новаторский подход к постановке данной задачи и способам ее решения позволяет планировать как новые патентные разработки, так и новые публикации на последующих этапах ПНИ.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Проведены теоретические и экспериментальные исследования механизмов импорта генетической конструкции в митохондрии. Установлена необходимость включения в генетическую конструкцию полноразмерного белка Abf2p. Показано, что клетки человека содержат систему импорта нуклеиновых кислот в митохондрии, организованную аналогично дрожжевой.
2. Проведены теоретические исследования механизмов супрессии мутаций в митохондриальном геноме, вызываемой импортом генетической конструкции. Были практически изучены возможные механизмы супрессии мутаций в митохондриальном геноме, вызываемой генетической конструкцией. Таким механизмом может быть гомологичная рекомбинация.
3.Выбрана в качестве рабочей модели «основная делеция» (8483-13459). Показан механизм возможного восстановления нативной ДНК посредством гомологичной рекомбинации.
4.Показана возможность использования генетической конструкции в лабораторной практике при работе с культурами клеток человека, а также выбран оптимальный модельный организм – пекарские дрожжи S.cerevisiae.
Тема исследования и ожидаемые результаты находятся в полном соответствии с аналогичными разработками ведущих мировых лабораторий, изучающих митохондриальные заболевания, что подтверждается публикациями в журналах.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Перспективы использования генетических конструкций для супрессии митохондриальных мутаций  необыкновенно велики. Нейродегенеративные дисфункции, вызванные митохондриальными мутациями, в настоящее время практически не поддаются лечению.
Наше исследование направлено на преодоление технологических и методологических трудностей в коррекции мутаций митохондриального генома.
Разрабатываемые генетические конструкции для корректировки митохондриальных дисфункций найдут широкое применение в современной медицине и ветеринарии.
Основными потребителями полученных технологий будут клиники, специализирующиеся на лечении заболеваний, вызванных мутациями ДНК, а также различные биотехнологические и научно-исследовательские лаборатории, работающие в данном секторе.

Текущие результаты проекта:
В ходе лабораторных исследований было показано, что фрагмент ДНК, аналогичный выпадающему фрагменту мтДНК при «основной делеции», встроенный в плазмиду, может проникать в митохондрии в результате генно-инженерных манипуляций. Более того, такая плазмида, при помощи механизма гомологичной рекомбинации, может вызывать супрессию в митохондриальном геноме модельных организмов S.cerevisiae.
В ходе серии экспериментов удалось показать, что увеличение эффективности импорта линейной двуцепочечной ДНК в изолированные митохондрии дрожжей находится в прямой зависимости от предварительной обработки ДНК-связывающим белком с сигналом импорта в митохондрии. Высказанное ранее предположение, что ДНК-связывающий дрожжевой белок Abf2p подходит для построения вектора подтвердилось. В свою очередь, эксперименты, направленные на снижение размеров белковой части вектора за счет создания рекомбинантных белков, аналогичных доменам HMG1 и HMG2, однозначно показали, что в функциональном смысле домены не заменяют полноразмерный белок. Векторы, полученные на основе доменов и синтетических олигонуклеотидов, обладали пониженной стабильностью. В результате этапа №2 ПНИ была доказана невозможность замены белка Abf2p любым из двух его доменов HMG1 или HMG2 для дальнейших генно-инженерных манипуляций по доставке конструкции в митохондрии. Было выявлено, что лучше импортируются фрагменты малого размера - до 250 пар нуклеотидов, но нам удалось показать положительные результаты и для транспорта генетической конструкции до 4 тыс. пар нуклеотидов.