Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка экспериментальной модели in vitro и in vivo для изучения патогенеза спорадической формы болезни Паркинсона, поиска биомаркеров заболевания и скрининга обладающих нейропротективными свойствами биологически активных соединений на основе природных регуляторных нейропептидов

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
регуляторные пептиды, нейропептиды, болезнь паркинсона, токсические повреждения, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, ips клетки, модель in vitro, модель in vivo, оксидантный стресс, выживаемость клеток, механизм действия, экспрессия генов, биомаркеры, дифференцировка, нейропротекция, нейротоксичность,тест-системы, нейроны, глия, нейротрофические факторы, апоптоз

Цель проекта:
Цель проекта – разработка комплексной экспериментальной модели болезни Паркинсона с сочетанием моделирования in vitro (на ИПС клетках и их производных) и in vivo (токсическая модель с введением крысам 6-гидроксидофамина) для тестирования потенциальных лекарственных средств, создание и тестирование на разрабатываемой модели серии пептидных препаратов с предполагаемой нейропротекторной активностью, выявление потенциальных биомаркеров для спорадической формы заболевания.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате выполнения работ по проекту будет создана комплексная экспериментальная модель для скрининга и анализа веществ, обладающих нейропротекторной активностью. Возможности данной системы, сочетающей анализ ИПС клеток in vitro и грызунов с токсической моделью патологического процесса на грызунах in vivo, будут продемонстрированы на примере анализа нейропротекторной активности нового семейства потенциальных пептидных лекарственных средств , созданных на основе препропептида нейропептида глиальных клеток GDNF. Данная модель также будет использована для поиска и анализа новых транскрипционных биомаркеров болезни Паркинсона и формирования панели таких биомаркеров для проведения ранней и доклинической диагностики болезни Паркинсона на основании анализа транскрипционного профиля клеток периферической крови.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Разработка экспериментальных моделей для выявления потенциальных биомаркеров и лекарственных мишеней для спорадической формы болезни Паркинсона, связанной с патологическими конформационными превращениями белков. Исходя из этого, в рамках проекта предполагается:
- разработать методику оценки нейропротективных свойств соединений с использованием разработанной экспериментальной модели, основанной на использовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона и создать экспериментальный образец тест-системы для отбора in vitro соединений, обладающих такими свойствами;
- разработать методику оценки нейропротективных свойств соединений in vivo на основе токсической модели болезни Паркинсона с введением крысам 6-гидроксидофамина;
- с использованием предложенных моделей провести оценку нейропротекторных свойств новых разработанных на основе природных регуляторных пептидов, образующихся при протеолитическом процессинге препропептида нейротрофического фактора глиальных клеток, пептидных препаратов с предполагаемой нейропротекторной активностью.
- выявить биомаркеры, связанные с развитием патологического процесса при болезни Паркинсона, и оценить возможность их использования для ранней и доклинической диагностики данного заболевания.

Решение этих задач возможно на основе анализа адекватной и перспективной экспериментальной модели, основанной на получении и использовании в системе in vitro ИПС клеток, полученных как от здоровых доноров, так и от пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона. го использования в экспериментах по направленной дифференцировке ИПС клеток в клетки нейронального ряда. Полученные линии ИПС клеток будут использованы для анализа нейропротекторной активности нового семейства пептидных соединений, разработанных в рамках выполнения проекта на основании пептидов из области препропептида фактора роста глиальных клеток (GDNF). Получаемые с использованием экспериментальной модели данные будут также использованы для выявления транскрипционных биомаркеров болезни Паркинсона. Эти маркеры будут проанализированы на выборке пациентов с болезнью Паркинсона с целью создания панели транскрипционных РНК маркеров для ранней диагностики заболевания.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Область применения - скрининг соединений различной химической природы для выявления потенциальных нейропротекторов и оценки уровня их нейропротекторной активности в системе in vitro на основе ИПС клеток и в системе in vivo на основе токсической модели нейродегенеративного заболевания. На основании этого скрининга может быть сформирована панель нейропротекторов для дальнейшего анализа возможности их клинического применения при лечении нейродегенеративных заболеваний и могут быть разработаны методы массового производства этих нейропротекторов для проведения клинических исследований данных соединений и отбора наиболее клинически эффективных нейропротекторов. В конечном итоге могут быть разработаны принципиально новые лекарственные средства для лечения пациентов с болезнью Паркинсона и профилактики данного заболевания.
Непосредственным потребителем ожидаемых результатов является индустриальный партнер - ЗАО ИНПЦ "Пептоген", который при выявлении новых обладающих нейропротекторными свойствами пептидов может наладить производство этих пептидов для проведения клинических испытаний препарата и, в конечном итоге, к производству товарных партий нейропротекторных пептидов. Тем самым может быть расширен круг фармпрепаратов, уже выпускаемых ЗАО ИНПЦ "Пептоген".
Разрабатываемый подход к выявлению веществ, обладающих нейропротекторной активность, с использованием сочетания моделей патологического процесса in vitro и in vivo, сможет эффективно дополнить уже существующие методы скрининга потенциальных нейропротекторов. Полученные в проекте данные, разработанные протоколы и регламенты могут быть применимы для обоснования и разработки клинического варианта терапии хронических нейродегенеративных заболеваний - причем не только болезни Паркинсона, но и других частых заболеваний нервной ткани. таких как болезнь Альцгеймера и хронические нарушения мозгового кровообращения.

Текущие результаты проекта:
На первом этапе проведения работ по соглашению написан аналитический обзор, который содержит самые последние данные зарубежной и отечественной науки о генетических маркерах и патогенетически значимых механизмах болезни Паркинсона, о методах лечения заболевания и методах его ранней диагностики. В обзоре также рассмотрены вопросы, связанные с моделированием патологического процесса при болезни Паркинсона с использованием клеточной модели in vitro и токсической модели in vivo. Проведенный анализ аналитических источников позволил сделать вывод о необходимости идентификации новых биомаркеров данного заболевания для максимально ранней диагностики заболевания и разработки новых подходов к терапии заболевания с использованием препаратов на основе синтетических регуляторных пептидов. Проведена оценка патентной чистоты проводимых работ. Анализ обширной базы патентных данных показал, что прямых аналогов, совпадающих с разрабатываемой темой, не обнаружено.
Для проведения работ по ПНИ созданы база данных пациентов с болезнью Паркинсона и коллекция образцов периферической крови и фибробластов от пациентов с болезнью Паркинсона и неврологически здоровых лиц. Проведено выделение РНК из образцов периферической крови пациентов и неврологически здоровых лиц для проведения транскриптомного анализа, из биоптатов кожи пациентов получена первичная культура фибробластов для дальнейшего получения ИПС клеток.
Получена экспериментальная модель патогенеза болезни Паркинсона на основе токсического повреждения области черной субстанции мозга крыс in vivo (50 крыс с верифицированным при экспериментах в открытом поле повреждением черной субстанции). Проведен анализ транскриптомного паттерна черной субстанции мозга крыс с экспериментальной моделью патогенеза болезни Паркинсона на основе токсического повреждения области черной субстанции мозга крыс in vivo, и выявлен ряд генов, которые можно отнести к группе генов кандидатов болезни Паркинсона.
Проведен отбор соединений, потенциально обладающих нейропротективными свойствами, и в результате сформирована группа из более 300 пептидов, представляющих интерес в качестве кандидатных пептидов для создания лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний. Из выделенной группы пептидов синтезировано и очищено 10 пептидов для дальнейшего экспериментального анализа их нейропротекторных свойств в моделях in vitro и in vivo. Разработан метод контроля контроля качества синтезированных в процессе выполнения работ по ПНИ пептидов.
В рамках второго и третьего этапа работы над проектом на основании ранее созданной коллекции фибробластов кожи были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПС) клетки от 3 пациентов с болезнью Паркинсона и от 4 здоровых лиц. Все полученные ИПС клетки охарактеризованы по морфологическим, цитогенетическим и молекулярно-биологическим критериям. Установлено, что все отобранные линии клеток имели нормальный набор хромосом и экспрессировали маркеры плюрипотентности, характерные для эмбриональных стволовых клеток человека. Разработаны протоколы нейрональной дифференцировки ИПС клеток и проводится сравнительный анализ нейронально дифференцированных клеток, полученных от здоровых лиц и пациентов с болезнью Паркинсона.
В периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона проведен анализ биомаркеров (транскрипционных маркеров) . В результате удалось сформировать панель транскрипционных РНК маркеров (включающую три гена, ATP13A2, PARK7, ZNF746). У пациентов с болезнью Паркинсона также изменена экспрессия гена SNCA – но изменение экспрессии этого гена наблюдается и при других неврологических заболеваниях. В связи с этим этот ген не был включен в состав панели транскрипционных биомаркеров для оценки возможности их использования в ранней и доклинической диагностики болезни Паркинсона. Разработана методика для анализа относительных уровней транскриптов генов ZNF746, PARK7, ATP13A2 для рутинного использования в лабораторной и клинической практике. Анализ экспрессии микроРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона показал, что уровень их экспрессии высоко чувствителен к проводимой при болезни Паркинсона терапии и может быть маркером эффективности проводимой терапии.
Проведен анализ влияния веществ с известной нейропротекторной активностью на состояние дофаминергических нейронов с использованием экспериментальной модели патогенеза болезни Паркинсона на основе токсического повреждения области черной субстанции мозга крыс in vivo. Полученные в результате изучения поведения экспериментальных животных с использованием различных поведенческих методик, позволяют предположить, что предваряющее нейротоксическое повреждение интраназальное введение семакса оказывает влияние на двигательную активность животных с повреждением дофаминергических нейронов черной субстанции и достоверно изменяет их эмоциональное состояние во время стрессорных воздействий. Это говорит о том, что данная модель болезни Паркинсона может быть использована для тестирования активности новых соединений с предполагаемой нейропротекторной активностью.
Проведены маркетинговые исследования российского рынка нейропротекторных препаратов. Показано, что в настоящее время наблюдается активный рост производства российских фармацевтических препаратов. В ближайшие годы объем рынка лекарственных средств по России может превысить 1 трлн руб., однако доля отечественных препаратов на рынке достаточно мала. Исходя из этого, наблюдаются большие возможности укрепления позиций отечественных производителей на фармакологическом рынке страны - особенно с учетом складывающейся экономической ситуации в целом. Объем мирового рынка лекарственных средств, применяемых при болезни Паркинсона, к 2016 г. может достичь 3,4 миллиардов долларов США, что на 10% больше, чем в 2006 г. В Российской Федерации потенциально болеющими болезнью Паркинсона в 2015 году могут быть более 250 тысяч человек. В связи с этим высоко актуальным является поиск новых методов терапии болезни Паркинсона с использованием инновационных лекарственных средств, разрабатываемых на основе современных представлений об этиопатогенезе болезни Паркинсона и учитывающих требования к минимальной токсичности пожизненно принимаемых препаратов. Исходя из требований минимальной токсичности, особый интерес представляют препараты на основе биологически активных пептидов. Такого рода препараты могут быть востребованы пациентами с болезнью Паркинсона или в качестве монотерапии, или в качестве одного из компонентов антипаркинсонической терапии.