Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка тест-систем для идентификации структурных перестроек генома опухолевых клеток и молекулярно-генетических характеристик пациента, определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
тест-система, острые лейкозы у детей, персонифицированная медицина, структурные перестройки генома, полиморфные маркеры, гены метаболизма лекарственных препаратов, гены иммунного ответа, дифференциальная диагностика, выбор терапии, прогноз

Цель проекта:
1. Повысить эффективность диагностики и лечения острых лейкозов у детей в результате разработки и внедрения высокотехнологичных методов молекулярно-генетического анализа. 2. Разработать методы идентификации молекулярно-генетических маркеров, определяющих выбор персонифицированной терапии при острых лейкозах у детей, на основе этих методов разработать тест-системы для определения генетических нарушений в опухолевых клетках и молекулярно-генетических характеристик пациента при острых лейкозах у детей с целью индивидуализации терапии.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Сформирована коллекция из 100 клинических образцов костного мозга детей с острыми лейкозами до лечения. Образцы охарактеризованы (цитогенетическое исследование, иммунофенотипирование, анализ на биочипах). Цитогенетически в образцах обнаружен широкий спектр хромосомных перестроек – 24 аберрации, приводящие к образованию химерных генов (у 80% пациентов), а также гиперплоидия (у 10% пациентов). С помощью биочипов (коммерческого набора «ЛК-Биочип») в образцах коллекции выявлены 12 известных структурных перестроек генома, приводящих к образованию химерных генов. В образцах коллекции проведен поиск дополнительных клинически значимых мишеней. Исследованы возможные способы решения задачи идентификации структурных перестроек генома в опухолевых клетках костного мозга, проведена их сравнительная оценка. Выбранный способ создания тест-системы основан на комбинации двух методических подходов: обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и аллель-специфичной гибридизации на биочипе. Сконструированы праймеры для обратной транскрипции и проведения ПЦР. Разработана панель из 22 наиболее информативных маркеров опухолевых клеток на основе химерных генов, определяющих различные подтипы заболевания, выбор терапии и прогноз у детей с острыми лейкозами: ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; MLL/AFF1; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1; MLL/MLLT3; CBFB/MYH11; MLL/MLLT10; MLL/MLLT1; SIL/TAL1; MLL/MLLT4; NPM1/ALK; TCF3/HLF; MLL/ELL; MLL/EPS15; PICALM/MLLT10; MLL/MLLT11; DEK/NUP214; RBM15/MKL1; FUS/ERG. Для каждого типа структурной перестройки генома составлен паспорт, включающий подробное описание перестройки и соответствующего химерного транскрипта, диагностическую и прогностическую значимость, частоту встречаемости у пациентов с лейкозами в разных возрастных группах. Проведен анализ информативности и клинической значимости выбранных маркеров. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотиды для выявления химерных генов методом гибридизации на биочипе. Подготовлены образцы ДНК и РНК (по 10 образцов) для последующего анализа методом высокопроизводительного секвенирования с использованием технологических платформ 454 (GSJunior) и Illumina с целью поиска новых молекулярных маркеров, определены физико-химические характеристики образцов ДНК и РНК. Для поиска генетических маркеров, ассоциированных с развитием тяжелых осложнений в ходе терапии, с использованием технологии жидких чипов NimbleGen Sequence Capture сформирована панель генов, включающая гены NOD2, NLRP3, STAT1, STAT3, CARD9, IL-10, IL-17RA, IL-12Rb1, IL-1, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, PTPN22, IL7, IL7R, MYD88. Выполнена работа по поиску редких перестроек (химерных генов) с участием гена MLL с использованием флуоресцентной гибридизации in situ в коллекции образцов 54 пациентов, перестройки с участием гена MLL выявлены у 37 пациентов. Идентифицирован ряд генов-партнеров, вовлеченных в перестройки. Проведена верификация выявленных структурных перестроек с участием гена MLL с помощью ПЦР и секвенирования. Использование длинной инвертированной ПЦР с последующим секвенированием позволило выявить 10 пациентов с редкими вариантами слияния генов, а также редкими перестройками MLL. Проведенное исследование подтвердило важность определения ранее выбранных маркеров: t(4;11)MLLAFF1; t(6;11)MLL-MLLT4; t(9;11)MLL-MLLT3; t(10;11)MLL-MLLT10; t(11;19)MLL-MLLT1; t(11;19)MLL-ELL. Также установлена целесообразность включения в панель маркеров следующих редких перестроек с участием гена MLL: t(1;11) (p32;q23)MLL-EPS15; 1;11)(q21;q23)MLL-MLLT11. Проведена экспериментальная проверка специфичности комплементарного взаимодействия иммобилизованных олигонуклеотидных зондов и флуоресцентно-меченых ДНК-мишеней при определении вариантов слияния генов.
С целью поиска новых химерных генов в опухолевых клетках больных лейкозом выполнено исследование транскриптома 10 образцов пациентов с лейкозами на платформе Illumina. Проведён биоинформационный анализ результатов высокопроизводительного секвенирования, выявлены редкие варианты химерных транскриптов . Результаты верифицированы секвенированием по Сэнгеру. Разработана эскизная конструкторская документация (ЭКД) на макет тест-системы для идентификации химерных генов. Определен остаточный пул опухолевых клеток после лечения у пациентов с разными формами острых лейкозов с использованием проточной цитофлуориметрии и ПЦР в реальном времени для оценки эффективности терапии. Сформирована коллекция контрольных образцов РНК с различными уровнями экспрессии химерных транскриптов (25 образцов) для определения аналитической чувствительности тест-системы для идентификации химерных генов при проведении испытаний. Оптимизированы условия мультиплексной ПЦР для амплификации последовательностей химерных генов в опухолевых клетках больных лейкозами.
2. Будет проведен выбор информативных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и в генах иммунного ответа, определяющих чувствительность к терапии и риск развития тяжелых осложнений у детей с лейкозами. Будет сформирована коллекция клинических образцов крови пациентов, получавших лечение (не менее 50 пациентов с разным ответом на лечение). Будет проведено таргетное секвенирование образцов пациентов, рефрактерных к терапии в рамках стандартных протоколов лечения, и пациентов с тяжелыми осложнениями в ходе лечения (не менее 10 образцов). Будет разработана техническая документация на макет тест-системы для выявления молекулярно-генетических характеристик пациента, влияющих на чувствительность к терапии и на развитие тяжелых осложнений. Будут изготовлены макеты тест-систем для идентификации химерных генов и для определения молекулярно-генетических особенностей пациента для проведения исследовательских испытаний и разработаны программы и методики испытаний. Будут проведены исследовательские испытания макетов тест-систем, разработаны лабораторные технологические регламенты изготовления макетов и проекты инструкций по применению тест-систем. Будут разработаны методики идентификации химерных генов в опухолевых клетках и полиморфных вариантов в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа. Будут разработаны рекомендации по возможности использования результатов ПНИ в практической медицине.
Макет тест-системы для идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) будет обеспечивать выявление и идентификацию любого из 22 информативных молекулярно-генетических маркеров (химерных генов) в клиническом образце. Специфичность метода идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) будет составлять не менее 95%, аналитическая чувствительность метода идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) составит не менее 1 опухолевой клетки на 10000 нормальных клеток. Макет тест-системы для анализа полиморфизма в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа будет обеспечивать выявление не менее 30 полиморфных маркеров. Специфичность метода определения полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа не менее 99 %.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом настоящего проекта являются макеты тест- систем и методики идентификации молекулярно-генетических маркеров, определяющих прогноз и выбор терапии при лейкозах у детей:
а) макет тест-системы и методика идентификации структурных перестроек генома (химерных генов) в опухолевых клетках;
б) макет тест-системы и методика идентификации полиморфных маркеров в генах метаболизма лекарственных препаратов и генах иммунного ответа (фармако- и иммуногенетический профили пациента).
Разработка инструментов анализа молекулярно-генетических маркеров, которые имеют принципиальное значение в диагностике, выборе стратегии лечения, прогнозе заболевания и ответе на терапию, позволит повысить эффективность лечения острых лейкозов у детей.
2. При разработке макета тест-системы в рамках данного проекта применены следующие новые технологические решения, которые позволят существенно улучшить технические характеристики тест-систем: 1) список анализируемых структурных перестроек на основе химерных генов расширен по сравнению с другими диагностическими панелями, что позволяет повысить эффективность диагностики острых лейкозов у детей; 2) для получения кДНК разработан оптимизированный набор специфичных праймеров обратной транскрипции, комплементарных 3’-участкам химерных генов, что позволяет повысить выход химерных кДНК-матриц; 3) при проведении мультиплексной ПЦР в разрабатываемой тест-системе использованы оригинальные праймеры, содержащие универсальные адапторы, что позволяет повысить мультиплексность системы;
4)флуоресцентное маркирование в разрабатываемой тест-системе проводится с использованием оригинальных высокоэффективных аналогов дезоксинуклеозидтрифосфатов, содержащих цианиновые красители (Cy5).
3. За последние годы с использованием микрочипов высокой плотности, секвенирования генов-кандидатов и высокопроизводительного секвенирования нового поколения, проведены широкомасштабные исследования генома клеток кроветворной системы, которые выявили большое количество новых структурных перестроек в опухолевых клетках, изменение копийности участков генома, соматических мутаций. В диагностике лейкозов и при выборе терапии необходимо учитывать все большее число молекулярно-генетических маркеров. Это делает актуальным разработку мультиплексных диагностических тест-систем для применения в рутинной клинической практике. Такие работы ведутся во всем мире, на рынке представлены мультиплексные тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, микрочипов высокой и низкой плотности. Разрабатываемые в проекте тест-системы имеют ряд преимуществ перед зарубежными аналогами.
4.Разработка двух тест-систем будет включать в себя стадии создания макетов и технической документации. Тест-системы являются новым технологическим продуктом, что обеспечивает возможность получения результата, способного к правовой охране. При разработке тест-систем использован опыт применения многопараметрического анализа в области изучения генома человека и создания диагностических тест-систем на основе технологии биологических микрочипов для диагностики различных заболеваний человека. Отработаны методы дизайна и синтеза праймеров, методы изготовления матриц гидрогелевых микроячеек с иммобилизованными ДНК-зондами. Для маркирования исследуемой ДНК в процессе амплификации разработаны методы синтеза флуоресцентных красителей.
Для поиска новых генетических маркеров используются методы секвенирования, в том числе метод высокопроизводительного секвенирования в центре коллективного пользования «Геном» ИМБ РАН. Клинические образцы для проведения исследований и поиска генетических маркеров, а также для испытания разработанных макетов тест-систем предоставляются соисполнителем ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Апробация разработанных методик и тест-систем для персонифицированного лечения будет проходить на базе специализированных клинических отделений ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, Российской детской клинической больницы (РДКБ), Московской городской детской клинической больницы и других областных и краевых клиник. ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева и выделяет собственные средства для проведения дополнительных испытаний разработанных макетов и разрабатывает рекомендации по внедрению результатов проекта в практическую медицину. Все это позволяет рассчитывать на успешную реализацию проекта.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1.Областью применения результата являются онкогематология, клиническая диагностика, педиатрия, биомедицина. Результаты работы могут быть использованы в дифференциальной диагностике и выборе терапии у детей с острыми лейкозами. Разрабатываемые тест-системы могут быть использованы в диагностических лабораториях медицинских центров, также они представляют интерес для проведения научных исследований в области онкологии и онкогематологии.
2.Разработанные макеты тест-систем могут быть доведены до стадии коммерческой разработки и производства на базе ООО «БИОЧИП-ИМБ», которое принимает участие в со-финансировании проекта. Заинтересованность в результатах связана с перспективой коммерциализации и последующего производства диагностических наборов. Дальнейшая коммерциализация включает разработку рабочей конструкторской документации, изготовление опытных образцов, проведение технических и медицинских испытаний и получение регистрационного удостоверения. Возможными потребителями результатов проекта являются ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, специализированные клинические отделения Российской детской клинической больницы (РДКБ), Московской городской детской клинической больницы и других областных и краевых клиник. Поскольку методы молекулярно-генетического анализа являются необходимым этапом клинической лабораторной диагностики лейкозов, и разрабатываемые в настоящем проекте тест-системы имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами молекулярно-генетического анализа, то их востребованность является достаточно обоснованной. Можно прогнозировать достаточно высокий уровень спроса на продукцию в клинической онкогематологии для рутинной клинической диагностики, ввиду постоянного потока пациентов, для которых данный анализ актуален.
3. В ходе выполнения проекта будут получены новые данные о молекулярно-генетических маркерах, определяющих форму заболевания, прогноз и выбор стратегии лечения. Результаты исследований могут быть использованы в оптимизации диагностических и лечебных мероприятий. Разработка тест-систем и внедрение высокотехнологичных методов молекулярно-генетического анализа в области онкогематологии будут способствовать повышению эффективности диагностики и лечения острых лейкозов у детей.
4. Результаты проекта будут способствовать проведению совместных научных исследований, в том числе, с зарубежными учеными в области изучения молекулярных механизмов развития лейкозов и поиска новых молекулярно-генетических маркеров и мишеней для терапии. Большой интерес к совместным исследованиям и использованию разрабатываемых тест-систем проявляют врачи-гематологи стран СНГ и ближнего зарубежья (Казахстан, Узбекистан, Киргизия).

Текущие результаты проекта:
На этапе 3 выполнения проекта
1. Проведен анализ генетических баз данных и выбраны информативные маркеры в генах метаболизма лекарственных препаратов и в генах иммунного ответа, определяющих чувствительность к терапии и риск развития тяжелых осложнений у детей с лейкозами.
2. Сформирована коллекция клинических образцов крови пациентов, получавших лечение (не менее 50 пациентов с разным ответом на лечение).
3. Проведено таргетное секвенирование образцов пациентов, рефрактерных к терапии в рамках стандартных протоколов лечения, и пациентов с тяжелыми осложнениями в ходе лечения (не менее 10 образцов) с использованием технологии жидких чипов NimbleGen Sequence Capture на технологической платформе 454 (GSJunior).
4. Проведен биоинформационный анализ результатов секвенирования, выявлены молекулярных маркеры эффективности лечения.
5. Разработана эскизная конструкторская документация на макет тест-системы для
выявления молекулярно-генетических характеристик пациента, влияющих на чувствительность к терапии и на развитие тяжелых осложнений.
6. Проведена верификация результатов таргетного секвенирования с целью выявления мутаций и полиморфизмов в генах метаболизирующих ферментов и генах иммунного ответа.
7. Создана коллекция контрольных образцов ДНК пациентов с известными генотипами (не менее 10).
8. Оптимизированы условия мультиплексной ПЦР для амплификации интересующих участков генов метаболизирующих ферментов и генов иммунного ответа.