Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание тканеинженерной конструкции на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур

Номер контракта: 14.604.21.0133

Руководитель: Дюжева Татьяна Геннадьевна

Должность: заведующая отделом гепатопанкреатобилиарной и регенеративной хирургии

Организация: федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)
Организация докладчика: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
регенеративная медицина, клеточные культуры, мезенхимальные стволовые клетки, желчные протоки, электроспиннинг, тканевая инженерия, внеклеточный матрикс, эндопротезы, биодеградируемые билиарные стенты, биомедицинский клеточный продукт

Цель проекта:
Целями данного проекта являются: 1 – разработка метода создания универсальной трехмерной нанобиоконструкции – тканеинженерной конструкции желчного протока из биосовместимых материалов нового поколения на уровне мировых разработок для придания требуемых свойств биологическим системам, способствующего развитию биологии и медицины, 1.1 – разработка тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с заданными свойствами для воспроизведения многослойных естественных живых структур. Необходимо решить ряд последовательных задач: 1- получение биосовместимого и биоразлагаемого материала для создания каркаса для трехмерных нанобиоконструкций, 2 - изготовление из полученного материала трубчатого каркаса, 3 - создание многослойной тканеинженерной конструкции, включающей биоразлагаемый каркас с клеточным покрытием.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате исследований, выполненных на 1 этапе, были отработаны условия проведения электроспиннинга, позволяющие получить волокнистые композитные материалы на основе полилактида и сополимера полиоксибутирата/полиоксивалерата, отвечающие требованиям для создания биосовместимого каркаса тканеинженерной конструкции, отработана технология получения и использования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.
На 2 этапе были разработаны технологические режимы для изготовления плоских образцов и трубчатых каркасов желчных протоков из биосовместимых биоразлагаемых нетканых материалов, по своим свойствам, приближающиеся к естественным. В качестве исходных полимеров использовались поликапролактон, сополимер D-L полилактида с полигликолидом, в соотношении 70-30% и диацетат целлюлозы, из которых были изготовлены плоские образцы нетканых волокнистых материалов с различной структурой и различным диаметром волокон, разработан «Лабораторный технологический регламент получения биосовместимого материала». В соответствии с лабораторным регламентом изготовлено 8 типов образцов биосовместимого материала (по 5 штук каждого размером 5х5 см). Образцы изготовлены из поликапролактона, сополимера D-L полилактида с полигликолидом и диацетата целлюлозы. Образцы изготовлены из нетканого материала с диаметром волокон от 1,2 (1,7) мкм до 11,0 мкм и плотностью упаковки от 5,5 до 17,2%, что позволяет не только определить зависимость величины пролиферации клеток от вида полимера, но и от структуры нетканого волокнистого материала. Изготовленные образцы имели толщину волокнистого слоя 0,15 до 0,86 мм.
Все образцы были охарактеризованы, изучены их структура, физико-механические свойства, определены их краевые углы смачивания. При изучении образцов использовалась оптическая микроскопия, атомно-силовая микроскопия и другие методы исследования.
На основании результатов, полученных при изготовлении плоских образцов, был разработан план исследований, направленных на создание каркаса для танеинженерной конструкции желчного протока. С помощью метода электроспиннинга изготовлены трубчатые экспериментальные образцы каркасов желчных протоков диаметром 4,3 мм, толщиной стенки от до 0,4 до 1,0 мм и длиной 3,5 см, что соответствует требованиям к биосовместимому каркасу, указанным в техническом задании. Изготовленные трубчатые образцы так же были всесторонне изучены с помощью современных исследовательских методик, включая методы оптической микроскопии, атомно-силовой микроскопии, измерения контактного угла смачивания, сканирующей электронной микроскопии.
Анализ показал, что разработанный технологический процесс изготовления экспериментальных образцов позволяет изготавливать их из волокон различного диаметра, в диапазоне от 1,2 мкм до 11,0 мкм, с различной плотностью упаковки и различным диаметром пор, в диапазоне от 10 до 67 мкм. Прочностные испытания показали, что прочность экспериментальных образцов практически такая же, как и прочность естественных желчных протоков. Исследование прочностных характеристик выявило примерно одинаковое соотношение величин продольной и поперечной прочности полученных каркасов, нативного и децеллюризованных желчных протоков, а так же модуля Юнга.
В результате проведения скрининга с применением линий клеток 3T3 и MCF7 и с использованием методов световой микроскопии и MTT-теста для оценки адгезии и пролиферации клеток выявлено, что наиболее биологически пригодны материалы: сополимеры полилактида с полигликолидом и диацетат целлюлозы. Была отработана технология получения и использования эпителиоцитов из ткани желчного протока.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечным результатом проекта будет являться опытный образец тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов с многослойным клеточным покрытием для использования in vivo.
Проведены патентные исследования, объектом которых явились методики выделения и культивирования эпителиоцитов общего желчного протока, что может быть использовано для восстановления многослойной трубчатой структуры. Идентичного решения не было найдено, что свидетельствует о патентноспособности объекта исследования. Готовится заявка на получение патента. Основным способом достижения поставленной задачи является электроформование многослойного трубчатого каркаса из нетканых материалов, изготовленных из нецитотоксичных полимеров с различной кинетикой деградации, в сочетании с заселенными на разных поверхностях каркаса культивированными клетками двух типов: мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и эпителиоцитов желчного протока. Технология электроспиннинга позволяет создавать подобные структуры. Ограничения применения опытного образца: тканеинженерная конструкция может быть применена только для пилотных доклинических исследований. Риски: длительная выживаемость клеток в конструкции может потребовать применения специального проточного биореактора с системой изолированной подачи двух несмешиваемых питательных сред. Данная ситуация может не возникнуть, т.к. есть примеры использования комбинированных смешанных питательных сред при создании тканеинженерных конструкций.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Необходимость разработки тканеинженерной конструкции желчного протока на основе биоразлагаемых и биосовместимых материалов обусловлена рядом причин. Возрастает число больных желчнокаменной болезнью. В мире производится около 1 млн. операций по удалению желчного пузыря (холецистэктомия). При этом частота повреждения желчных протоков остается на высоком уровне: при открытой операции составляет 0,1-0,8%, при лапароскопической холецистэктомии колеблется от 0,3 до 3%, при резекции желудка - 0,14%. Современные методы хирургического лечения повреждений желчных протоков сопровождаются большим количеством осложнений.
Будет разработана потенциально коммерциализуемая технология, которая позволит создавать новые продукты регенеративной медицины – трубчатые органы, а также, которая создаст задел для разработки более сложных технологий формирования солидных органов.
Разработанные технологии формирования трубчатых тканеинженерных конструкций безусловно будут способствовать международному сотрудничеству в области разработки, доклинических и клинических исследований биомедицинских клеточных продуктов.
Для российского здравоохранения результаты ПНИ будут, несомненно, важны, т.к. на базе ведущего вуза Минздрава начнут функционировать инфраструктура создания и выведения на рынок новых видов продукции – биомедицинских клеточных продуктов, и будут реализовываться механизмы воплощения инновационных идей в конечный продукт.


Текущие результаты проекта:
Разработаны и представлены в отчете за 2 этап (01.01. 2015- 30.06.2015) следующие документы:
1. Лабораторный технологический регламент получения биосовместимого материала
2. Акт изготовления экспериментальных образцов биосовместимого материала
3. План исследований, необходимых для создания каркаса для тканеинженерной конструкции желчного протока
4. Протоколы исследования взаимосвязи между структурой и свойствами образцов биосовместимого каркаса
5. Протоколы исследований по скринингу полученного биосовместимого материала в виде пленки с применением линий клеток
6. Отчет об отработке технологии получения и использования клеточных культур эпителиоцитов желчных протоков.

Разработаны и будут представлены в отчете за 3 этап (01.07.2015-31.12.2015):
1. Лабораторный технологический регламент получения биосовместимого каркаса для создания тканеинженерной конструкции желчного протока
2. Изготовленные экспериментальные образцы биосовместимого каркаса для формирования тканеинженерной конструкции желчного протока
Заканчиваются испытания кинетики биодеградации экспериментальных образцов биосовместимого каркаса в различных средах и разработка СОП забора биоматериала источника клеток, его транспортировки, выделения клеток (мезенхимальных стромальных/стволовых клеток костного мозга, эпителиоцитов желчных протоков), их культивирования, заморозки/криохранения, характеризации с помощью проточной цитофлоуриметрии. Эти данные также будут представлены в отчете за 3 этап.