Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение препаратов рекомбинантных гидролитических ферментов для кормоподготовки и ветеринарии

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
гены гидролаз, клонирование генов, рекомбинантные продуценты, бактериолитические гидролазы, осахаривающие гидролазы, ферментные препараты для кормов животных и ветеринарии, трёхмерная структура белков

Цель проекта:
1. Задачей, которая решается в ходе выполнения проекта - обеспечение сельского хозяйства препаратами ферментов, как новыми, не имеющими аналогов, так и препаратами, способными заместить импортные аналоги. 2. Цель реализуемого проекта: разработка ферментных препаратов двух типов - рекомбинантных осахаривающих гидролаз, предназначенных для улучшения питательных свойств кормов животных, и - бактериолитических ферментов, в качестве антимикробных средств для ветеринарии.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов:
- Поиск, клонирование и анализ генов гидролаз различных штаммов бактерий, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов;
- Получение рекомбинантных продуцентов, наработка рекомбинантных гидролаз, изучение свойств рекомбинантных гидролаз;
- Разработка ферментных препаратов и их испытание;
- Изучение трехмерной структуры рекомбинантных гидролаз.
2. Основные характеристики планируемых результатов
- Поиск генов гидролаз будет проведен среди бактерий с опубликованным в GeneBank полным геном для тех видов, штаммы которых депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Среди опубликованных геномов будет проведен поиск генов гидролаз на основании консервативных доменов характерных для различных групп гидролаз. Обнаружение консервативных доменов необходимо для предсказания возможной активности гилролаз, поскольку наличие определенных доменов в последовательности белка может свидетельствовать о принадлежности гидролазы к определенной группе с характерной активностью. На основании анализа будут отобраны гены сахаролитических гидролаз: целлюлаз, гемицеллюлаз, амилаз, бета-глюканаз, бета-глюкозидаз, а так же гены литических протеаз и мурамидаз. На основании отобранных последовательностей генов будут разработаны праймеры для метода ПЦР, с помощью которого будет проводиться наработка генов гидролаз. Гены, полученные с помощью ПЦР, будут секвенированы. Будет секвенирован и аннотирован геном бактерии Lysobacter sp.
- На основе клонированных генов гидролаз будут получены рекомбинантные продуценты. Будет проведена работа по разработки оптимальной системы экспрессии рекомбинантных гидролаз. Оптимизация системы экспрессии необходима для подбора системы экспрессии, обеспечивающей максимальный выход гидролаз с наименьшими затратами (затраты на среду культивирования, время культивирования, затраты на стоимость индуктора и т.п.), что важно для получения ферментных препаратов. Отдельная работа по получению рекомбинантных продуцентов литических гидролаз. Рекомбинантные литические гидролазы при значительной продукции могут лизировать клетки рекомбинантного продуцента. Будут опробованы два способа решения этой проблемы: наработка литических гидролаз в неактивном состоянии в виде телец включения с последующей их реактивацией в процессе выделения; использование рекомбинантных продуцентов на основе хозяина, который не гидролизуется литическими гидролазами, например грибных продуцентов. Для получения рекомбинантных продуцентов будут использованы подходящие коммерческие системы экспрессии на оcнове продуцентов бактерий и грибов, например, представителей родов Bacillus, Pseudomonas, Pichia, Saccharomyces. Рекомбинантные гидролазы будут получены в электрофоретически гомогенном состоянии. После получения препаратов рекомбинантных гидролаз будет проведено исследование их свойств. Препараты осахаривающих гидролаз будут охарактеризованы по субстратной специфичности в отношении различных полисахаридов. Субстратная специфичность литических ферментов будет охарактеризована по их способности гидролизовать клеточные стенки (пептидогликаны) грамположительных и грамотрицательных бактерий. Будет исследована литическая активность рекомбинантных литических гидролаз в отношении патогенных и антибиотикоустойчивых форм бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Pseudomonas, Bacillus.
- По результатам изучения свойств рекомбинантных ферментов будут отобраны сахаролитические гидролазы, обладающие наибольшей термостабильностью, высокой удельной активностью в отношении полисахаридов, необходимым оптимумом рН. Будут отобраны литические гидролазы с наибольшей термостабильностью и наибольшей литической способностью в отношении патогенных бактерий. На основе рекомбинантных гидролаз будут разработаны ферментные препараты гидролаз и проведена проверка их свойств. Ферментные препараты для улучшения питательных свойств кормов на основе осахаривающих гидролаз будут получены с помощью смешивания рекомбинантных гидролаз. Оптимальное сочетание гидролаз будет найдено экспериментально. Будет проведена работа по определению условий хранения ферментных препаратов и стабилизации их активности при хранении. Для стабилизации в ферментные препараты будут вносить стабилизаторы в различных концентрациях (соли, сахара, детергенты). Будет разработана используемая форма препаратов (жидкая, лиофилизованная, гранулированная). Будет проведена отработка условий масштабного получения ферментных препаратов – в ферментёрах. После разработки ферментных препаратов и наработки опытных образцов препаратов будет проведены исследовательские испытания их свойств. Будут испытаны свойства осахаривающих препаратов гидролаз по улучшению питательных свойств сырья для кормов животных. Будут испытаны литические свойства препаратов в отношении патогенных бактерий и изучен лечебный потенциал на модельных инфекциях, вызванных в т.ч. устойчивыми к антибиотикам штаммами Staphylococcus aureus (MRSA), Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, смоделированных у белых мышей. По результатам проделанной работы будут разработаны технологические лабораторные регламенты получения ферментных препаратов и рекомендации по применению ферментных препаратов.
- Для расшифровки трехмерной структуры рекомбинантных гидролаз в первую очередь необходимо получить пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы лакказ. Будет проведен поиск условий кристаллизации рекомбинантных гидролаз в свободном состоянии, полученные кристаллы будут протестированы на генераторе рентгеновского излучения. С пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов будут собраны наборы дифракционных данных с использованием источника синхротронного излучения и определены пространственные структуры. Для кристаллизации будут использоваться рекомбинантные гидролазы как обладающие высокой термостабильностью или высокой литической способностью, так гидролазы с лучшими свойствами. После расшифровки структуры будет проведено сравнение полученных структур гидролаз как друг с другом, так и со структурами гидролаз, депонированными в базе PDB, для которых были описаны физико-химические свойства (будут исследованы литературные данные). Будут выявлены аминокислотные остатки аминокислот активных центров литических гидролаз, ответственных за литическую активность ферментов. Путём сравнения структур термостабильных и нетермостабильных рекомбинантных гидролаз будут идентифицированы аминокислотные остатки, стабилизирующие молекулу гидролазы.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом проекта будут лабораторные технологически регламенты и рекомендации по их применению для препаратов ферментов для осахаривания растительного сырья с целью улучшения качества кормов и бактериолитических ферментов, применяемых в ветеринарии как антимикробные средства;
2. Новизна заключается в применении для отбора ферментов технологиии "быстрого скрининга генов" - High Throughput Screening (HTS) технологии, предполагающей использование одновременного массированного клонирования перспективных генов, кодирующих целевые ферменты, а также в использовании уникальных бактериолитических ферментов грам-отрицательной бактерии Lysobacter sp.
3. Запланированные результаты и используемые методы сопоставимы с работами мирового уровня.
4. Достижение запланированных результатов основано на использовании уникальной для РФ HTS-технологиии, кооперации специалистов различных научных центров (ИБФМ РАН, Институт белка РАН, Центр прикладной микробиологии) и сотрудничестве с индустриальным партнером (ООО Органик Парк). Возможные риски связаны с недостаточной эффективностью экспрессионных систем и недостаточно высокой рентабельностью технологических процессов производства ферментов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Разрабатываемые ферментные препараты для улучшения свойств кормов животных и ветеринарии предназначены для применения в животноводстве.
2. После завершения проекта планируется масштабирование разработанных в ходе реализации проекта технологических регламентов производства ферментов лабораторного уровня до промышленного масштаба. Индустриальный партнер (ООО Органик Парк) завершает проектирование производственных линий и строительство завода для решения этих вопросов и последующего производства ферментных препаратов.
3. Применение ферментных препаратов для осахаривания кормов снижает затраты на корма животных, что снизит себестоимость продукции. Спрос на ферментные препараты обеспечивается растущим рынком их сбыта, как в России, так и в мире. Препараты гидролаз для лечения и профилактики бактериальных заболеваний способны замещать антибиотики при лечении животных. Препараты способны к патентованию за счет использования гидролаз, ранее в патентах не заявленных, получения уникальных композиций гидролаз, активных в отношении различных групп бактерий, использования гидролаз уникального штамма Lisobacter sp. Препараты для ветеринарии способны лечить бактериальные заболевания животных, что обеспечивает увеличение производства животной продукции и её качества. Спрос на препарат может обеспечивается способностью их замещать антибиотики, отсутствием на рынке аналогов со сравнимой эффективностью.
4. Полученные результаты будут опубликованы в периодической научной печати, будут поданы заявки на изобретение, будут представлены на отечественных и международных конференциях.

Текущие результаты проекта:
- В 2014 г. были отобраны штаммы, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов, в геноме которых содержатся гены осахаривающих и бактериолитических гидролаз. Среди геномов отобранных бактерий проведён поиск генов, кодирующих осахаривающие гидролазы и бактериолитические гидролазы. Обнаружено более 200 генов, кодирующих гидролазы. Отобранные штаммы были культивированы, получена биомасса бактерий, из биомассы выделена тотальная ДНК. Проведены работы по клонированию генов. Секвенирован геном бактерии Lysobacter sp. В геноме идентифицированы 5 генов, кодирующих уникальные бактериолитические гидролазы. Проведён патентный поиск по тематике проекта. Проведено исследование рынков осахаривающих и бактериолитических препаратов. Созданы проекты бизнес-планов производства и продажи препаратов на основе осахаривающих и бактериолитических гидролаз. были написаны праймеры для клонирования генов гидролаз в экспрессионный вектор.
- В 2015 были получены 31 рекомбинантный штамм на основе E.coli, 9 рекомбинантных штаммов на основе Kluyveromyces lactis, 58 рекомбинантных штаммов на основе Pichia pastoris. Исследована продукция осахаривающих и бактериолитических гидролаз рекомбинантными продуцентами. Обнаружено, что гидролазы эффективно экспрессируются в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli и Pichia pastoris, но не в Kluyveromyces lactis. Всего получено 55 рекомбинантных продуцентов гидролаз: 24 на основе E. coli и 31 на основе Pichia pastoris. Всего получено продуцентов: 12 ксиланаз, 11 протеаз, 3 фитазы, 9 лизоцимов, 5 бета-глюкозидаз, 5 амилаз, 10 целлюлаз. Разработаны лабораторные методики получения рекомбинантных продуцентов. Получены препараты 51 рекомбинантного белка. Полученные белки были охарактеризованы. Получены кристаллы рекомбинантных гидролаз, пригодные для рентгено-структурного анализа.