Регистрация / Вход
Прислать материал

Экспресс-идентификация чувствительности злокачественных глиом человека к онколитическим вирусам

Номер контракта: 14.607.21.0014

Руководитель: Чумаков Петр Михайлович

Должность: Главный научный сотрудник, и.о. зав. лаб. пролиферации клетки

Аннотация скачать
Ключевые слова:
онколитический вирус, энтеровирус, парамиксовирус, полиовирус, злокачественные опухоли головного мозга, мультиформная глиобластома, глиома, астроцитома, терапия, диагностика, персонифицированная медицина, пцр, экспрессия генов, ксенографты, органная культура, культура клеток, репликация вируса, вирусные рецепторы, активирующие протеазы

Цель проекта:
Целью проекта является разработка технологии персонифицированной медицины, позволяющей определять чувствительность злокачественной опухоли головного мозга конкретного пациента к терапевтическому действию онколитических вирусов тем самым позволяя производить подбор наиболее эффективного штамма онколитического вируса. . Разработка подходов к лечению рака с помощью вирусов является актуальным и перспективным направлением онкологии. Клетки злокачественных опухолей как правило приобретают повышенную чувствительность к вирусам, чему способствует несколько механизмов. Это и утрата систем противоопухолевого иммунитета клеток, нарушение тканевых барьеров внутри опухоли, повышенная проницаемость сосудов внутри опухоли, усиление экспрессии ряда поверхностных белков, служащих в качестве рецепторов для проникновения вирусов. В качестве онколитических выступают исходно непатогенные вирусы человека и животных, вакцинные аттенуированные штаммы, а также искусственные мутантные и рекомбинантные вирусы, неспособные размножаться на нормальных клетках. Онколитические вирусы разрабатываются на основе нескольких вирусных семейств, как РНК, так и ДНК содержащих. Наиболее перспективным является разработка онколитических вирусов на основе исходно непатогенных для человека вирусных штаммов. Уничтожение опухолевых клеток в организме пациента как правило не сопровождается токсическими проявлениями. В основе вирусного онколиза лежат различные механизмы - прямое уничтожение опухолевых клеток вирусами, стимуляция противоопухолевого иммунитета, способность разрушать внутриопухолевую васкулатуру. Дополнительным преимуществом онколитических вирусов является их способность уничтожать стволовые клетки опухоли, которые особо устойчивы к действию химиотерапевтических препаратов. Несмотря на потенциальные преимущества онколитической терапии одной из основных проблем является непредсказуемость терапевтического действия применяемого вирусного штамма поскольку опухоли могут значительно различаться по чувствительности к тому или другому онколитическому вирусу. Чувствительность обусловлена наличием на поверхности злокачественных клеток специфических рецепторов, обеспечивающих проникновение вируса, а также рядом других факторов, необходимых для репликации отдельных вируса. Задачей проекта является экспериментальное установление связи между экспрессией в конкретной опухоли определенных генных маркеров и способностью клеток этой опухоли эффективно размножать определенный штамм онколитического вируса. На основе этой информации планируется разработка экспресс-теста, который позволит осуществлять подбор наиболее эффективного терапевтического вирусного штамма для последующего введения конкретному пациенту . В качестве модели для разработки такого теста нами были выбраны злокачественные опухоли головного мозга, что обусловлено, в первую очередь, исключительно негативным прогнозом течения таких заболеваний. Часто радикальное удаление опухоли головного мозга невозможно по причине угрозы развития неврологического дефицита. Применение вируса обеспечит избирательное уничтожение оставшиеся злокачественных клеток, в том числе стволовых клеток опухоли, которые часто располагаются в отдаленных от опухоли участках мозга. При выполнении проекта будут отработаны процедуры поддержания кусочков опухоли пациентов в культуре (органные культуры), которые далее будут использованы для экспериментального испытания способности опухолей пациентов поддерживать размножение отдельных онколитических вирусных штаммов. Фрагменты этих же опухолей будут использованы для анализа экспрессии ряда генов (CD155, CAR, CD55, ICAM-1, DAF, Integrin α2β1, CD46, TMPRSS2, HAT и другие), функция которых может влиять на чувствительность к применяемым онколитическим вирусам. В результате будет установлена корреляция между экспрессией отдельных генных маркеров и чувствительностью злокачественных глиом к тому или иному штамму онколитических вирусов. На основе полученной информации будет разработаны PCR-тесты для экспресс-идентификации чувствительности опухоли конкретного пациента к онколитическим вирусам, что позволит проводить выбор наиболее эффективных для данного пациента терапевтических штаммов. В качестве терапевтических штаммов будут использованы вакцинные штаммы полиовируса I, II и III типов, представители вирусов ECHO и Coxsackie, а также к онколитический вариант мышиного парамиксовируса Сендай. Таким образом, в задачи проекта входит: -проведение скрининга коллекции культур клеток злокачественных опухолей головного мозга на предмет их чувствительности к панели онколитических энтеровирусов и парамиксовирусов; -определение способности набора онколитических вирусов размножаться и вызывать онколиз ксенотрансплантатов клеток злокачественных опухолей головного мозга, имплантированных в мозг иммунодефицитных мышей; -определение способности онколитических вирусов уничтожать опухолевые стволовые клетки; -совершенствование технологии получения органных культур из опухолей головного мозга; -определение способности опухолей пациентов размножать различные штаммы онколитических вирусов в условиях органной культуры; -определение способности онколитических вирусов избирательно уничтожать опухолевые клетки пациента в органной культуре; -разработка ПЦР-теста на определение экспрессии генов, обуславливающих способность опухолевых клеток поддерживать размножение отдельных штаммов онколитических вирусов (гены, кодирующие специфических вирусные рецепторы, протеазы, необходимые для созревания вируса); -определение уровней экспрессии генов, необходимых для эффективного размножения отдельных штаммов онколитических вирусов в образцах РНК, полученных из панели культур клеток злокачественных опухолей мозга человека, а также из клинических образцов опухолей, для которых было проведено определение их чувствительности к набору онколитических вирусных штаммов; -выявление взаимосвязи между способностью культур клеток или опухоли конкретного пациента размножать онколитический вирус и экспрессионным профилем генов, ответственных за чувствительность к определенной группе вирусов; -с помощью технологии РНК-интерференции определение влияния экспрессии генов, кодирующих специфические вирусные рецепторы и мембранные протеазы на способность клеток заражаться и поддерживать репликацию онколитических вирусов; -разработка экспресс-теста на основе ПЦР, позволяющего предсказывать чувствительность опухоли конкретного пациента к тому или иному онколитическому вирусу из имеющейся панели; -разработка технологии на основе биоселекции для получения вирусных штаммов с расширенным спектром воздействия на злокачественные опухоли головного мозга; -формирование панели штаммов вирусов, предназначенных для доклинических и клинических испытаний в качестве онколитических препаратов направленных против злокачественных опухолей головного мозга.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения проекта планируется выявит закономерности взаимосвязи между экспрессией генов ряда поверхностных бнлков клеток, используемых вирусами в качестве рецепторов, и фактической чувствительностью образков опухолей пациентов к панели онколитических вирусов. Для осуществления этой программы предстоит разработать адекватные методы получения жизнеспособных клеток из биоптатов и операционного материала, их криоконсервирования для последующего анализа размороженных и жизнеспособных образцов, методы определения чувствительности органных культур и культур ранних пассажей к литическому действию вирусов, их способность поддерживать размножение вирусов. Предстоит отработать методы получения мозговых ксенотранплантатов на бестимусных мышах и методы определения их чувствительности к вирусам после интракраниального стереотаксического введения. Анализ экспрессии ряда генных маркеров предстоит отработать путем постановки ПЦР в реальном времени. Для этого будут дизайнированы и валидированы праймеры, соответствующие требуемым параметрам ПЦР реакции. Для получения новых штаммов онколитических вирусов с повышенным тропизмом предстоит отработать адекватную процедуру биоселекции на культурах клеток, в которых будут выключены отдельные критические компоненты, необходимые для поддержания вирусной инфекции, а также клеточные линии, исходно слабо поддерживающие репликацию данного вирусного штамма.
В результате проведенной работы будут получены диагностические тесты, которые позволят прогнозировать чувствительность опухоли конкретного пациента к панели онколитических вирусов. Будут получены новые штаммы онколитических вирусов с расширенным тропизмом. Все инновационные разработки и их продукты будут запатентованы.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Как уже отмечено выше, задачей проекта является создание тестов персонифицированной медицины, основанных на новых биомаркерах злокачественных глиом человека, которые позволяют предсказывать чувствительность опухоли конкретного пациента к набору онколитических вирусов. Это будут диагностические тесты на основе ПЦР. Кроме этого, методами направленной эволюции и биоселекции будут получены новые штаммы онколитических вирусов, обладающих расширенным тропизмом и способные размножаться и убивать более широкий круг злокачественных глиом человека.
Результаты проекта и создаваемые продукты позволят после проведения соответствующих доклинических и клинических испытаний добиться внедрения нового инновационного способа терапии злокачественных глиом, тем самым повысив время выживаемости пациентов, страдающих этим пока абсолютно неизлечимым заболеванием. Задача предсказания персонифицированной чувствительности опухолей пациентов в мировой литературе не описана и, по доступным нам источникам информации, пока никем не ставилась, что указывает на инновационный характер и приоритетное значение данных работ. Используемые нами подходы к биоселекции новых онколитических вирусов на охарактеризованных и специально сконструированных линиях опухолевых клеток также никем не применялись и не обсуждались в научной литературе. Таким образом эти работы не имеют аналогов в мировой биомедицинской науке.
Поставленные задачи предполагается решать с помощью следующих подходов:
Определение чувствительности операционных образцов злокачественных глиом к набору онколитических штаммов вирусов будет проводится поэтапно – вначале на панели культур клеток злокачественных глиом, затем - в органных культурах, полученных дезинтеграцией образцов злокачественных глиом пациентов.
Будет оптимизирована процедура приготовления органных культур – как из свежеполученного операционного материала, так и после предварительной криоконсервации.
В качестве in vivo модели будут использованы внутримозговые ксенотрансплантаты глиомных линий человека на иммунодефицитных бестимусных мышах.
Определение способности вирусных штаммов размножаться в условиях культур клеток и органных культур будет проводиться путем заражения, последующей инкубации в культуре и титрования вирусного урожая на чувствительных культурах клеток.
Действие онколитического вируса будет определяться по измерению выживаемость глиомных клеток (ХТТ-тест), изменению динамики роста опухоли (MRT-тест), увеличению титра введенного вируса.
Анализ экспрессии генных маркеров будет проводиться с помощью ПЦР в реальном времени.
Для верификации данных по корреляции экспрессии генных маркеров и чувствительности к вирусам будут использованы модельные линии клеток с подавленной с помощью РНК-интерференции или искусственно усиленной экспрессией того или иного маркера.
Селекция вариантов вирусов, обладающих расширенным тропизмом в отношении злокачественных глиом будет проводиться путем серийных пассирований на исходно нечувствительных линиях клеток глиобластом с последующим определением типа вирусного рецептора, к которому произошла адаптация.
Реалистичность поставленных задач подтверждается рядом исследований коллектива и существенными экспериментальными заделами.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разрабатываемы диагностические тесты и новые онколитические вирусы с расширенным тропизмом предназначены для применения в нейроонкологических клиниках для повышения эффективности лечения пациентов с злокачественными опухолями мозга.
Практическое внедрение результатов исследований будет осуществляться после прохождения доклинических и клинических испытаний. Заинтересованность в поддержке таких испытаний высказывается НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко и индустриальным партнером – НПО Микроген.
Внедрение разрабатываемых результатов в клиническую практику откроет широкие перспективы для совершенствования эффективности лечения злокачественных глиом мозга, особенно случаев с распространенным поражением мозга, которые в настоящее время терапии не поддаются. В ходе исследований будет также укреплена материально-техническая база ИМБ РАН, что позволит осуществлять новые исследования в области разработки инновационных терапевтических средств.

Текущие результаты проекта:
Проведен сбор операционного материала злокачественных опухолей головного мозга для дополнения коллекции органных культур злокачественных опухолей головного мозга. С помощью ПЦР в реальном времени проанализирован экспрессионный профиль панели генов, необходимых для эффективного проникновения в клетки и репродукции используемых онколитических вирусов и на основании полученных результатов отобраны гены-кандидаты, определение экспрессии которых может быть использовано для сопоставления со способностью клеток пациентов поддерживать размножение различных штаммов онколитических вирусов. Проведена оптимизация методики получения органных культур злокачественных опухолей головного мозга. Проведено испытание и определение чувствительности коллекции линий культур клеток злокачественных опухолей головного мозга к исходной панели онколитических энтеровирусов и парамиксовирусов. Получены сублинии культур клеток злокачественных опухолей головного мозга с подавлением экспрессии отдельных специфических вирусных рецепторов, сублиний клеток, экспрессирующих репортерные конструкции (ген люциферазы и гены флуоресцентных белков). Проведено испытание туморогенности органных культур злокачественных опухолей головного мозга при введении в мозг иммунодефицитным мышам, с определением динамики роста опухоли. Эти клетки будут использованы в дальнейшем в качестве модели для оценки вирусного онколиза в условиях in vivo. Испытаны альтернативные способы доставки онколитических вирусов в мозговые ксенографты на иммунодефицитных мышах in vivo (на модели бестимусных мышей).
Проведено исследование коллекции полученных органных культур в ходе которого получена количественная оценка репродукции вирусов, определена выживаемость стволовых клеток злокачественных глиом in vitro, определена динамика роста ксенографтов органных культур опухолей головного мозга, их чувствительность при введении онколитических вирусов. Оценена способность исходной панели штаммов
энтеровирусов человека и мышиного вируса Сендай убивать стволовые клетки опухоли и предотвращать рецидивы заболевания на модели ксенографтов злокачественных опухолей головного мозга в иммунодефицитных мышах. Определена динамика накопления вируса в опухоли и биологических жидкостях (кровь, моча) после введения вируса, а также время персистирования вируса в организме мышей, несущих опухоли и при введении контрольным мышам. Проведено сравнение эффективности вирусного онколиза и химиотерапевтического препарата Тимозоломида (Тимодал) на модели опухолевых мозговых ксенотрансплантатов. С помощью ПЦР определен профиль экспрессии отобранных маркеров в злокачественных опухолях головного мозга, подлежащих воздействию онколитическими вирусами. Для верификации данных полученных путем анализа экспрессии на уровне транскрипции (ПЦР тестирование) отработана иммунологическая детекция белков вирусных рецепторов на поверхности клеток с помощью иммунофлуоресценции и Вестерн блоттинга. Определены параметры созревания парамиксовируса Сендай в органных культурах клеток злокачественных опухолей головного мозга, экспрессирующих различные уровни трансмембранных протеаз. Определены уровни экспрессии трансмембранных протеаз в образцах органных культур злокачественных опухолей головного мозга для их сопоставления с данными о чувствительности органных культур к литическому действию вируса Сендай.