Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение и анализ безмаркерных биотехнических растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1.

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
антимикробные пептиды, цекропин р1, трансгенные растения, генетическая трансформация, каланхоэ перистое, kalanchoe pinnata l., фармацевтика, лекарственные растения

Цель проекта:
В настоящее время антибиотики микробного происхождения остаются наиболее массово применяемым типом терапевтических препаратов. Рынок антибиотиков неуклонно растет. Однако, этот процесс привел к ответной реакции со стороны большинства массовых бактериальных возбудителей. С началом применения нового антибиотика в популяциях Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa и других микробных возбудителей практически всех социально значимых инфекций в короткий срок распространяются генетические детерминанты устойчивости к нему. Наиболее ярко этот процесс можно проиллюстрировать на примере полусинтетических цефалоспоринов 3-го поколения, которые практически утратили терапевтическую эффективность в течение трех лет с начала их массового коммерческого применения. С биологической точки зрения антимикробные пептиды животного или растительного происхождения представляют собой эффективную альтернативу антибиотикам микробного происхождения, так как процесс выработки к ним популяционной устойчивости у бактерий занимает длительное время. Соответственно, период эффективного использования нового препарата удлиняется, рентабельность и социально-экономический эффект новых разработок этого типа мог бы оказаться, таким образов, выше, чем в случае традиционных антибиотиков. Однако, массовое применение антимикробных пептидов животного происхождения в фармацевтике до сих пор сдерживается недостатком экономически конкурентоспособных и безопасных методов их синтеза. Каланхоэ – род растений, в который входит ряд видов с ценными лекарственными свойствами. Сок каланхоэ традиционно используется как биогенный стимулятор иммунитета и ранозаживляющее средство. За счет придания каланхоэ способности к синтезу антимикробного пептида цекропина Р1 возможно существенное усиление естественных лекарственных и фармакологических свойств этого растения. Цекропин Р1 это 31-членный пептид, относится к группе линейных α-спиральных пептидов. Он проявляет антимикробную активность против патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и патогенных грибов Sclerotinium sclerotiorum, Fusarium oxysporum и других патогенов. Получение растений каланхоэ с геном антимикробного пептида цекропина Р1, не содержащих маркеров лекарственной устойчивости, открывает путь к их использованию в качестве биофабрики для синтеза антимикробных пептидов, поскольку этот подход позволяет придать им биологическую биобезопасность, критически необходимую для растений фармацевтического назначения. Трансгенные растения представляют собой перспективную систему для экспрессии целевых белков и пептидов для медицинских целей, поскольку при малотоннажном производстве себестоимость АМП, выделенных из трансгенных растений, оказывается в 20-30 раз ниже по сравнению синтетическими пептидами. АМП, продуцируемые рекомбинантными бактериями и грибами, менее перспективны для фармацевтического применения, чем АМП растительного происхождения, так как они требуют полной очистки от эндотоксинов и индукторов врожденного иммунного ответа. Кроме того растения безопаснее других продуцентов фармакологической субстанции, так как они заведомо свободны от любых патогенов человека и животных. Целью проекта является получение научных результатов в области биотехнологии синтеза рекомбинантного антимикробного пептида цекропина Р1 в растениях каланхоэ перистого, позволяющих переходить к созданию на их основе новых антибиотических препаратов фармацевтического назначения. Новая технология с успехом может быть применена и для создания продуцентов многих других АМП, что позволяет в перспективе принципиально создать новый сегмент ранка антибактериальных средств.

Основные планируемые результаты проекта:
Основные планируемые результаты проекта:
1. Создание безмаркерных бинарных векторных конструкций, несущих ген антимикробного пептида цекропина Р1 (сес Р1).
2. Усиление экспрессии целевого гена путем использования суперпромоторов и генетических элементов усиления трансляции мРНК.
3. Проверка эффективности полученных генетических конструкций на модельных растениях табака
4. Получение синтетического цекропина Р1
5. Получение антител к цекропину Р1
6. Разработка и оптимизация методов высокоэффективной трансформации каланхоэ перистого на основе агробактериальной инфильтрации.
7. Подбор оптимального состава среды для регенерации трансгенных побегов каланхоэ перистого путем исследования различных комбинаций фитогормонов в среде.
8. Разработка стратегии получения безмаркерных растений с помощью прямого анализа функциональной активности продукта гена и его иммунохимической детекции в растительных экстрактах.
9. Сравнение уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях под контролем различных промоторов.
10. Молекулярно-генетический и физиолого-биохимический анализ полученных трансгенных растений каланхоэ перистого.
11. Разработка методов получения экстракта сесР1-растений каланхоэ, для применения в фармакологии и медицине
12. Исследование функциональной стабильности цекропина Р1 при хранении экстракта
13. Разработка метода выделения препарата пептида цекропина Р1 из растений каланхоэ перистого
14. Исследование устойчивости безмаркерных сесР1-растений к фитопатогенам. Анализ их экологической безопасности

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Впервые получены пригодные для практического применения растения каланхоэ перистого (K. pinnata), экспрессирующие ген антимикробного пептида цекропина Р1. Сок этих растений может использоваться как сырье для получения очищенных препаратов цекропина Р1 и непосредственно, в качестве антибактериального средства наружного применения в чистом виде и в качестве биодобавки в мази, кремы, спреи и т.д. Полученные растения не содержат маркерных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам, что является благоприятно сказывается на их безопасности. Это обстоятельство расширяет область их использования в фармакологии, медицине и сельском хозяйстве. Полученные растения неприхотливы при культивировании, быстро размножаются, демонстрируют высокую стабильность целевого продукта при хранении, обладают высоким содержанием целевого пептида цекропина Р1: до 0,2% ОСБ.
За последние 5 лет. мировой фармацевтической промышленностью на разработку новых антибиотиков было затрачено свыше 30 млрд. долларов США. С учётом перспективности АМП в качестве реальной альтернативы антибиотикам,

Быстрое развитие резистентности многих патогенных микроорганизмов к лекарственным средствам заставляет искать альтернативу традиционным антибактериальным терапевтическим средствам. Некоторые АМП животного и растительного происхождения достаточно перспективны в этом качестве. Мировой зарубежный рынок антимикробных пептидов оценивается объемом свыше 1 млрд. долларов. На рынке присутствуют АМП, изготовляемые с помощью органического синтетического производства или синтезируемые в бактериальных экспрессионных системах, Оба эти похода требуют тщательной, многоступенчатой и, следовательно, дорогостоящей очистки. В России рынок АМП пока не сложился. Наиболее гибким и экономически эффективным способом, дающим гарантированно высокую биологическую активность продукта, является синтез пептидов в растениях. В настоящее время пептиды, в том числе антимикробные, выделенные из растений, находятся на стадии доклинических и клинических испытаний в ряде зарубежных стран.

Цена 1 г цекропина Р1, поставляемого глобальной торговой компанией Sigma-Aldrich составляет 18 000 000 руб. (1 мг – 18 000 руб.). Себестоимость получения 100 кг растительной биомассы каланхоэ для получения 1 г цекропина Р1 в теплице - 20 000 руб. (выращивание 1-го растения – 25 руб.) Цена выделения и очистки 1 г цекропина Р1 из 200 кг растений (при уровне накопления ~0,03% от ОРБ) (включая реактивы, амортизацию оборудования и зарплату) не превышает 1 000 000 руб.

Вывод: Цена получения антимикробного пептида из растений может быть почти в 20 раз ниже по сравнению с его химическим синтезом. Для получения одной линии растений-продуцентов нового пептида потребуется срок около трех лет при наличии финансирования не менее 10-12 млн. в год. Параллельно можно разрабатывать до трех линий растений.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Наименование прикладного результата:
1. Сок трансгенного каланхоэ, содержащий цекропин Р1, с повышенной антимикробной активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов человека и животных.
2. Технология производства очищенного препарата цекропина Р1 универсального фармацевтического назначения из трансгенных растений K. pinnata.

Область применения разработки: медицина, фармакология, ветеринария

Портрет покупателя
1. Фармацевтические компании, имеющие опыт коммерческого применения пептидов в фармацевтике
Magainin Pharmaceuticals, Micrologix Biotech, Entomed S.A., Sigma
2. Фармацевтические компании, специализирующиеся в области производства противоожоговых и ранозаживляющих средств, в том числе, ветеринарных препаратов
ЗАО «ВИФИТЕК» (функционирует на базе Института Лекарственных растений), ОАО «Химикофармацевтический комбинат «АКРИХИН», ООО «Фармапарк», ООО «Ветеринарные препараты», компании, специализирующиеся в области получения лекарственного растительного сырья в закрытом грунте

Сценарии использования нового продукта
1. Продажа лицензии на исключительное использование Способа получения генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Р1, защищенного патентом РФ. В разработке могут быть заинтересованы компании, планирующие вывод на рынок товарных рядов АМП.
2. Продажа лицензии на исключительное или неисключительное использование Способа получения сока из генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Р1.
3. Продажа лицензии на исключительное или неисключительное использование Технологии получения антимикробного пептида цекропина Р1 на основе биобезопасных трансгенных растений каланхоэ перистого.

Текущие результаты проекта:
В результате выполнения второго этапа работ получены нижеследующие основные результаты.
1. Разработана система эффективной регенерации побегов каланхоэ перистого, позволяющая получать генетически стабильные растения-продуценты цекропина Р1. К началу выполнения проекта описания оптимальных условий регенерации K. pinnata в литературе отсутствовали. С учётом этого в рамках проекта была разработана методика эффективной регенерации трансгенных побегов каланхоэ перистого. Для определения оптимального состава среды для регенерации были исследованы различные комбинации фитогормонов в среде. Предложена следующая комбинация фитогормонов в среде: 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 0,1 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 30 г/л бананового порошка (Banana powder, Sigma). Частота регенерации на данной среде составила около 40%.
2. Разработанный ранее метод генетической трансформации каланхоэ перистого, основанный на кокультивации листовых эксплантов с агробактериями (патент РФ № 2445768), обладал недостаточной эффективностью. Поэтому в рамках данного проекта был разработан новый более эффективный метод вакуумной инфильтрации семян каланхоэ перистого. Наиболее оптимальной оказалась экспозиция семян под вакуумом в течение 5 минут при отрицательном давлении -0.8 атм., частота трансформации при этом составила 35%. Этот метод снимает зависимость от морфогенетического потенциала растений, устраняет возможность появления сомаклональных вариантов и значительно ускоряет процедуру трансформации.
3. Разработана методика селекции трансформантов каланхоэ с повышенным уровнем продукции трансгена с помощью экспериментальной инфекции растений бактериальными фитопатогенами. Прямой скрининг растений, синтезирующих антимикробный пептид цекропин Р1, основан на детекции антибиотической активности экстрактов каланхоэ перистого методом радиальной диффузии в агаровых блоках в отношении практически важного бактериального фитопатогена Erwinia carotovora, а также стандартной тест-культуры E. coli D22.
4. Разработан метод прямого иммунологического отбора трансформантов на способность к высокой продукции цекропина Р1, основанный на вестерн-блот анализе экстрактов из листьев каланхоэ перистого. Чувствительность вестерн-блот анализа в наших экспериментах позволила детектировать в экстрактах трансгенных растений цекропин Р1 в количестве 1 нг/100 мкг общего белка. Разработанная стратегия прямого скрининга безмаркерных трансформированных растений по продуктам экспрессии целевых генов обладает важными преимуществами перед другими методами. Отобранные с помощью этого метода трансгенные растения изначально не содержат селективных маркеров, что не требует трудоёмких операций по их удалению. Кроме того, метод позволяет добиваться получения растений с наиболее высокой жизнеспособностью, что обеспечивает высокую генетическую и физиологическую стабильность признака продукции целевого вещества.
5. Разработана общая лабораторная методика получения трансгенных линий каланхоэ перистого. Основные пункты разработанной методики получения высокопроизводительных безмаркерных трансгенных линий каланхоэ перистого для всех типов векторов включает следующие пункты:
а. Трансформация растений методом вакуумной агроинфильтрации;
б. Прямая селекция трансформантов двумя параллельными методами: тестрированием антибактериальной активности экстрактов и/или иммунологической детекции продукта (вестерн-блот анализ);
в. Контроль наследования трансгенов.

6. Исследована зависимость эффективности трансформации от свойств генетической конструкции и способа трансформации каланхоэ перистого. Частота трансформации безмаркерным вектором pBM с геном цекропина Р1 выше, чем при трансформации векторами с селективными маркерами. Вероятно, это связано с тем, что в условиях трансформации снижена продолжительная стрессовая нагрузка, вызывающая метилирование ДНК и замолкание трансгена.