Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т лимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли.

Номер контракта: 14.607.21.0043

Руководитель: Сенников Сергей Витальевич

Должность руководителя: руководитель отдела

Докладчик: Курилин Василий Васильевич, ответственный исполнитель

Организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии"
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
дендритные клетки, антиген-специфические цитотоксические т-лимфоциты, онкология, опухолевые антигены, способы доставки антигенов в клетку, позитивные и негативные регуляторы активности клеток, мрнк, днк-конструкции, цитокины, клеточный препарат

Цель проекта:
Реализуемый проект направлен на разработку протоколов получения клеточных препаратов для персонализированной клеточной иммунотерапии эпителиальных форм онкологических новообразований на основе оригинального протокола культивирования дендритных клеток, который предполагает сократить сроки получения зрелых дендритных клеток и в последующем сократить сроки создания персонализированного клеточного препарата на основе зрелых антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-клеток. Целью реализуемого проекта является разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения ПНИ планируется получить следующие научно-технические результаты:
- экспериментальные образцы ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для различных форм злокачественных новообразований;
- лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток;
- лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток;
- методика создания ДНК конструкции, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований;
- методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки;
- лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью;
- проект протокола ограниченного клинического исследования и оценки эффективности и безопасности противоопухолевой клеточной иммунотерапии пациентов с онкопатологией.
- проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологий клеточной иммунотерапии больных эпителиальными формами рака».

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Разработана методика создания ДНК-конструкции, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований. Получен экспериментальный образец ДНК-конструкции (в количестве 5 мг), представляющий собой смесь семи поли-ЦТЛ-эпитопных иммуногенов и одного поли-Т-хелперного иммуногена, которые кодируют 323 эпитопа от 26 опухоль-ассоциированных антигенов, наработана и очищена от эндотоксинов с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit (“Qiagen”, США) в соответствии с рекомендациями производителя (чистота ДНК-конструкции составляет 99%).
Разработана методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки, с анализом двух методов: нуклеофекции и магнитной трансфекции и оценкой, как проникновения плазмиды в клетку, продукции закодированного белка, так и по оценке конечного эффекта цитотоксичности в отношении опухолевых клеток. Полученные данные в таком формате представлены впервые и позволят эффективно выбирать метод переноса генетического материала, как для научных исследований, так и для разработки клеточных препаратов для терапии пациентов.
К настоящему моменту разработаны лабораторные регламенты получения зрелых фенотипически и функционально полноценных дендритных клеток от больных раком молочной железы и колоректальным раком, а также немелкоклеточным раком легкого. Достигнутые показатели по экспрессии специфических маркеров являются с точки зрения мировой научной литературы достаточными для формирования культуры активных антигенпрезентирующих клеток. В представленном лабораторной регламенте подробно описаны используемые подходы временных режимов культивирования и добавления стимулирующих агентов. Полученный протокол будет использован в качестве основы для создания протокола получения активированных мононуклеарных клеток против злокачественных новообразований.
Разработан лабораторный регламент получения антиген-специфических Т-лимфоцитов против клеток экспрессирующих опухоль-ассоциированный антиген Her2/neu. Полученные впервые в мире результаты показали эффективность проводимых процедур как по идентификации антиген-специфических клеток, так и по сепарации и стимуляции пролиферации культуры этих клеток. Показана достоверная цитотоксичность получаемой культуры антиген-специфических клеток против опухолевых клеток.
Разработан лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток рака молочной железы. Получено статистически значимое увеличение индукции цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных раком молочной железы против опухолевых клеток при сокультивировании с дендритными клетками, трансфицированных ДНК-конструкцией, по сравнению с контрольными группами. При подборе различных модуляторов для усиления цитотоксической реакции, а именно провоспалительных цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-18), ингибиторов IDO (L-метил-1-триптофан) и COX-2 (целекоксиб) положительный эффект на цитотоксический противоопухолевый клеточный ответ достигнут при совместном применении ИЛ-12 и ИЛ-18.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты работы могут быть применимы в области персонифицированной медицины в рамках специализированной медицинской помощи как индустриальным партнером (ЗАО «Компания Витамакс»), так и федеральными и региональными медицинскими центрами для широкого применения разработанных подходов клеточной иммунотерапии больных с раком молочной железы, колоректальный рак и немелкоклеточный рак легкого, а также других эпителиальных форм злокачественных новообразований. Помимо этого, результаты работы, возможно, применять для вторичной профилактики рецидива онкологического процесса и у пациентов с наследственной предрасположенностью развития эпителиальных форм опухолей. Использование разработанных протоколов для создания клеточных препаратов для профилактики онкологических заболеваний является важным конкурентным преимуществом по сравнению с современными иммунопрепаратами.

Текущие результаты проекта:
Проведен дизайн и синтез искусственных генов, кодирующих семь поли-ЦТЛ-эпитопных иммуногенов, с оптимизацией кодонового состава для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих. Также был проведен дизайн и синтез искусственного гена, кодирующего поли-Т-хелперный иммуноген. На основе проведенного дизайна разработана методика создания ДНК-конструкции, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) для различных эпителиальных форм злокачественных новообразований. Получен экспериментальный образец ДНК-конструкции (в количестве 5 мг), представляющий собой смесь семи поли-ЦТЛ-эпитопных иммуногенов и одного поли-Т-хелперного иммуногена, которые кодируют 323 эпитопа от 26 опухоль-ассоциированных антигенов, наработана и очищена от эндотоксинов с помощью набора EndoFree Plasmid Giga Kit (“Qiagen”, США) в соответствии с рекомендациями производителя (чистота ДНК-конструкции составляет 99%).
С использованием двух методов транзиентной трансфекции проведен сравнительный анализ и разработана методика доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки.
Разработан лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток от больных колоректальным раком, раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого. С использованием созданного лабораторного регламента на материале от больных раком молочной железы получены данные для разработки лабораторного регламента получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток.
Разработан лабораторный регламент получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против опухолевых клеток, включающий методику окраски антигенспецифических клеток; методику магнитной сепарации Her2-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов; создана схема культивирования и стимуляции пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов, и проведена оценка эффективности формирования специфического цитотоксического иммунного ответа по развитию прямого цитотоксического эффекта против опухолевых клеток.
Разработан лабораторный регламент получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток рака молочной железы, включая подбор сочетания факторов – провоспалительных цитокинов (ИЛ-12, ИЛ-18), ингибиторы IDO и COX-2 при сокультивировании дендритных клеток с мононуклеарными клетками онкобольных.
Разработан метод доставки ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухолеспецифических антигенов, в дендритные клетки с использованием адресных катионных липосом. Проведен скрининг маннозилированных липосом на основе катионных липосом 2Х3, липида-хелпера DOPE (в мольном отношении 1:2) и маннозилированных липоконъюгатов, состоящих из D-маннозы и диалкилглицерина, соединенных через сукцинильный или скватратный линкер, в процентном соотношении 2.5%, 5% и 10%, по эффективности доставки ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши, экспрессирующие маннозные рецепторы. Выявлена наиболее эффективная липосомальная композиция М6, содержащая в составе 10% маннозилированных липоконъюгатов, состоящих из D-маннозы и диалкилглицерина, соединенных через скватратный линкер, и протокол доставки ДНК.
Определена адресность доставки РНК, кодирующей эпитопы опухолеспецифических антигенов, с помощью маннозилированных катионных липосом в дендритные клетки. Показано, что все маннозилированные липосомы специфично связываются с аналогом маннозного рецептора конканавалином А in vitro. Липоплексы М6 с РНК меланомы В16 при введении in vivo здоровым животным индуцировали клон ЦТЛ с эффективностью специфического лизиса клеток меланомы, которая был в 2,2 и 1,7 раза выше по сравнению с эффективностью лизиса меланомы нестимулированными спленоцитами и спленоцитами, стимулированными контрольными липосомами 2Х3-DOPE.
Проведен анализ активации воспалительного ответа на липоплексы, состоящие из маннозилированных липосом и опухолевой РНК, in vitro и in vivo. Показано, что так же как и контрольные липосомы 2X3-DOPE, маннозилированные липосомы после трансфекции незрелых ДК in vitro приводили к повышению уровней векреции ДК ИЛ-6 и ИФН-γ, которые являются маркерами ответа ДК на стимулы созревания/активации. Введение ДК мышам с меланомой В16 не приводило к повышению уровня провоспалительных цитокинов в крови.
Подготовлены 7 статей, из них опубликовано 4 в журналах, индексируемые в Scopus и Web of Science, и 1 статья в журнале, индексируемом в РИНЦ, подготовлена 1 заявка на патент РФ на изобретение.