Регистрация / Вход
Прислать материал

Биотехнологическая конверсия растительного сырья в карбоновые, молочную и фумаровую, кислоты для их использования в синтезе биополимеров

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
молочная кислота, фумаровая кислота, биополимеры, карбогидразы

Цель проекта:
Получение технических сахаров как питательной среды для дальнейшего микробиологического синтеза продуктов с высокой добавленной стоимостью является актуальной задачей в условиях наличия доступной и дешевой субстратной базы для ферментативного осахаривания. Такой высокопродуктивной сельскохозяйственной культурой может служить топинамбур, богатый природным полисахаридом-инулином. Для биоконверсии инулина необходимо использовать фермент экзоинулиназу (биокатализатор, обладающий экзо-активностью и гидролизующий инулин до моносахаров- глюкозы и фруктозы). Далее, полученные сахара могут быть конвертированы в популярные органические кислоты, молочную и фумаровую, являющиеся моноблоками при химическом синтезе биополимеров. Таким образом, целью прикладных научных исследований (ПНИ) является разработка технологических основ экологически безопасного и энергоэффективного процесса ферментативной конверсии растительного (инулинсодержащего) сырья в технические сахара и эффективного способа получения карбоновых кислот, как полупродуктов для химического синтеза биополимеров, в том числе:ферм -) разработка ферментативного процесса конверсии непищевой растительной биомассы в технические сахара; -) разработка эффективного способа микробиологического получения карбоновых (молочной и фумаровой) кислот; -) масштабирование процесса переработки инулинсодержащего сырья в карбоновые кислоты на базе ООО "Краснодарский биоцентр".

Основные планируемые результаты проекта:
Научно-технические результаты ПНИ следует разделить на теоретические, экспериментальные и технические.

К теоретическим результатам ПНИ относятся:
-) анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к теме биоконверсии растительного сырья с получением карбоновых кислот;
-) патентные исследования по отдельным этапам разрабатываемой технологической цепочки;
-) обобщения и выводы по результатам ПНИ;
-) паспорта рекомбинантных штаммов;
-) рекомендации и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера
-) требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - ООО "Краснодарский биоцентр".

К техническим результатам ПНИ относятся:
Набор лабораторных методик (ЛМ), таких как:
-) ЛМ определения концентрации белка в ферментных препаратах;
-) ЛМ определения состава сахаров в ферментативных гидролизатах непищевого растительного сырья;
-) ЛМ определения инулиназной активности в ферментных препаратах;
-) ЛМ селективного отбора продуктивного штамма-продуцента фумаровой кислоты;
-) ЛМ селективного отбора продуктивного штамма-продуцента молочной кислоты;
-) ЛМ получения фумаровой кислоты на основе простых сахаров;
-) ЛМ получения молочной кислоты на основе простых сахаров;
-) ЛМ синтеза биополимера на основе карбоновой кислоты.
Программы и методики испытаний экспериментальных образцов (ПМ), в том числе:
-) ПМ ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов, карбоновых кислот (молочной и фумаровой);
-) ПМ экспериментальных образцов фумаровой кислоты в новых гидролизных средах;
-) ПМ экспериментальных образцов молочной кислоты в новых гидролизных средах.
Лабораторные технологические регламенты (ЛТР) биоконверсии растительного сырья в карбоновых кислот, в том числе:
-) ЛТР получения ферментных препаратов с повышенной гидролитической способностью по отношению к предобработанной инулинсодержащей биомассе растений;
-) ЛТР получения фумаровой кислоты;
-) ЛТР получения молочной кислоты.
Проект ТЗ на ОТР «Биоконверсия некрахмального растительного сырья в органические (окси- и дикарбоновые) кислоты».

К экспериментальным результатам относятся:
-) экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов-продуцентов карбогидраз (целлюлаз и инулиназ).
-) экспериментальные образцы штаммов микроорганизмов-продуцентов фумаровой кислоты
-) экспериментальные образцы штаммов микроорганизмов-продуцентов молочной кислоты
-) экспериментальные образцы ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов-продуцентов карбогидраз (целлюлаз и инулиназ).
-) экспериментальные образцы карбоновых кислот - молочной и фумаровой, полученных на основе растительного сырья, предназначенных для синтеза биополимеров.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечная продукция разработки будет представлена (или уже представлена) следующими образцами:
-) образцами ферментных препаратов с содержанием инулиназ, содержащих не менее 45% целевого белка и обеспечивающих не менее 35% конверсии полисахаридов исходного сырья в простые сахара в течение 24 ч процесса ферментативного гидроли-за при загрузке [фермент]: [возобновляемая биомасса предобработанного растительного сырья] - не более [1:100] по массе. Данный результат уже получен.
-) образцами гидролизатов, полученных на основе биоконверсии предобработанной возобновляемой биомассы топинамбура с концентрацией восстанавливающих сахаров - не менее 35г/л, при этом присутствие моносахаридов, таких как глюкоза, фруктоза должно быть не менее 85% от суммы восстанавливающих сахаров. Результат получен.
-) образцами биокатализаторов для микробиологической трансформации простых сахаров, которые должны выдерживать накопление фумарата и лактата в концентрации до 80 и 60 г/л для фумарата и лактата, соответственно. Результат получен.
-) образец фумаровой кислоты с содержанием основного вещества не менее 95%.
-) образец молочной кислоты с содержанием основного вещества не менее 80%.
Вся научно-техническая продукция, создаваемая в рамках текущего проекта является новой.

Ферментные препараты, предназначенные для гидролиза инулин-содержащего сырья с получением фруктоолигосахаридов, выпускают компании Novozymes (Novozym 960, Novozym 230, представляющие собой смесь инулиназ эндо- и экзодействия), а также компания Beldem, выпускающая ферментный препарат эндоинулиназы под маркой Oligofructase 3000.
Лабораторный ферментный препарат экзоинулиназы, разработанный в ФИЦ Биотехнологии РАН отличается более высоким содержанием активной экзоинулиназы, и, соответственно, более высоким уровнем экзоинулиназной активности, позволяющей получать моносахара- фруктозу и глюкозу, необходимые для роста бактерий рода Lactobacillus и гриба Rhyzopus- основных продуцентов молочной и фумаровой кислот.
Ограничения и риски проекта связаны с масштабированием разрабатываемых процессов на мощностях ООО "Краснодарский биоцентр". Однако, данные результаты будут получены в 2016 г.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Коммерческий интерес к предлагаемой разработке очевиден, поскольку связан с приоритетным направлением использования возобновляемых источников сырья для получения коммерчески значимых продуктов, в том числе полупродуктов для химического синтеза.
Кроме того, коммерческий интерес к результатам ПНИ можно ожидать со стороны компаний, занимающихся производством кормов для животных и препаратов для сельского хозяйства (Novus International, Inc., США, "Daavision B.V.", Нидерланды, Nutriad, Бельгия), так как фумаровая кислота имеет свойства консерванта.
Также данная разработка может быть интересна производителям биоразлагаемых композиционных материалов: группа компаний Ренова (Россия), BASF The Chemical Company, Германия, Lamagrain, Франция, Natureworks, США, TyssenKrupp, Германия, Novamont, Италия, SPHERE, Франция, Plantic, Австралия, Innovia, США, непосредственно, Европейской ассоциации биопластиков «European Bioplastics».
Очевидным будет интерес и к результатам ПНИ со стороны организаций, занимающихся химическим синтезом, в частности, со стороны ОАО Татхиминвест-холдинга, ОАО СИБУР Холдинг, ООО "Пластик" , готовых осваивать новые биотехнологические процессы, тем более те, которые позволяют в ходе одного процесса получать комплекс коммерчески значимых продуктов.
Полученные в результате выполнения ПНИ научно-технические результаты могут лечь в основу разработки эффективной и экологически безопасной технологии биоконверсии некрахмального растительного сырья в карбоновые кислоты, которые являются необходимыми блоками при синтезе биополимеров, таких полилактиды, например. Разработанная техническая документация позволит оценивать качество конечной продукции- фумаровой и молочной кислот на любой стадии оптимизации процесса их микробного синтеза, что, в свою очередь, даст возможность оценить конкурентоспособность разрабатываемой технологии в сравнении с имеющимися в мировой практике.

Текущие результаты проекта:
1. В результате исследования гидролитической способности новых рекомбинантных штаммов на предобработанных клубнях и стеблях топинамбура выбраны штамма- Penicillium verruculosun INU13 и Penicillium verruculosum INU18. Штаммы депонированы в Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов.
2. Получен биокатализатор синтеза фумаровой кислоты, представляющий собой гриб Rhizopus oryzae F-1032, иммобилизованный в криогеле поливинилового спирта. Показано, что наилучшие результаты (порядка 70% конверсии общих сахаров в фумаровую кислоту) достигается в случае разбавления гидролизатов клубней топинамбура в 3 раза и использования иммобилизованных клеток гриба.
3. Получены два типа биокатализаторов синтеза молочной кислоты - на основе бактериальных клеток Lactobacillus casei B-3960 и грибных клеток Rhizopus oryzae F-814. Оба биокатализатора были также иммобилизованы в криогеле поливинилового спирта. В случае биокатализатора на основе клеток мицелиального гриба R. oryzae F-814 использование ферментативных гидролизатов клубней и стеблей топинамбура в качестве исходного сырья для получения МК обеспечивает накопление в среде до 12 г/л МК, при этом выход МК по глюкозе варьируется от 30 до 193%. При использовании же биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток бактерий L. casei В-3960, конечная концентрация молочной кислоты, получаемой из глюкозы, фруктозы, ксилозы и арабинозы была не менее 20, 20, 4 и 3 г/л, соответственно.
4. Показано, что для наработки конечного продукта фумаровой и молочной кислоты наиболее перспективным и экологически чистым сырьем являются измельченные клубни топинамбура.
5. Показано, что в случае клубней топинамбура достаточно механического измельчения сырья, однако, в случае стеблей топинамбура предобработка органозольвом в большей степени повышает реакционную способность данного субстрата, чем предобработка разбавленной кислотой, хотя требует рекуперации растворителя.
6. Разработаны Программы и методики испытания экспериментальных образцов.
7. Ведутся разработки Лабораторных технологических регламентов на получение ферментных препаратов экзоинулиназы, а также получения фумаровой и молочной кислот из растительного сырья топинамбура.
8. Готовится заявка на патент "Ферментный препарат экзоинулиназы и способ его получения".
9. По результатам проекта в 2016 г. опубликовано 4 статьи в таких журналах как: Биохимия (WoS, Scopus), Process Biochemistry (WoS, IF=2,5), Прикладная биохимия и микробиология (WoS, Scopus), Вестник МГУ (Scopus).
10. Были сделаны доклады в тематике проекта на 3-х международных конференциях: Umea renewable energy, Швеция (25-27.03.2015), 10 международная научная конференция Биокатализ 2015 (Истра, Московская обл, 21-26.06.2015) и IX Международная научная конференция «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, Белоруссия, 7-11.09.2015).