Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка бифункциональных агентов на основе рекомбинантных белков суперсемейства иммуноглобулинов и лигандов поверхностных рецепторов патологических лимфоцитов для направленной терапии лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
аутоиммунные заболевания, рак, рассеянный склероз, в-клеточные лимфомы, в-клеточный рецептор, fc-фрагмент антител, химерный антигенный рецептор, гкгс, эаэ

Цель проекта:
1. Разработка и получение бифункциональных агентов белковой природы на основе рекомбинантного белка константного фрагмента иммуноглобулина (Fc), слитного с пептидами-аутоантигенами или пептоидами, взаимодействующими с В-клеточным рецептором аутореактивных лимфоцитов, для направленной элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе (РС) – MBP84-106-Fc (1а), MBP147-170- Fc (1б), MOG35-55-Fc (1в) и AMogP3-Fc (1г) 2. Разработка и получение бифункциональных агентов на основе пептидов-аутоантигенов отдельно или в комплексе с белками суперсемейства иммуноглобулинов и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII), для направленной элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе в составе лентивирусов – MBP84-106-CARIII (2а), MBP147-170-CARIII (2б), MBP84-106-HLA_DR2b-CARIII (2в), MBP147-170-HLA_DR2b-CARIII (2г), TCR_Ob1.A12-CARIII (2д) 3. Разработка и получение бифункциональных агентов на основе специфического лиганда рецепторов лимфомных клеток различной этиологии и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII) для направленной элиминации злокачественных В-клеток в составе лентивирусов – Lymphpep7aaLig-CARIII (3).

Основные планируемые результаты проекта:
1). Проведение анализа научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме и патентных исследований по исследуемой теме; создание лабораторных методик оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность адресных бифункциональных агентов in vitro и получения:- бифункциональных агентов 1а-1в, - пептоида AMogP3, - бифункционального агента 1г, - бифункциональных агентов 2а-2д и 3; наработка экспериментальных образцов адресных бифункциональных агентов с терапевтическим потенциалом – агенты 1а-1г, 2а-2д, 3; создание лабораторных методик проведения трансдукции T-клеток лентивирусами, содержащими гены бифункциональных агентов на основе CARIII (агенты 2 и 3), и исследования направленного подавления патологических лимфоцитов (агенты 1-3); создание лабораторных регламентов получения адресных бифункциональных агентов с лучшим терапевтическим потенциалом; создание технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера - организации реального сектора экономики, а также проекта ТЗ на ОТР по проведению полного комплекса доклинических испытаний наиболее перспективного адресного бифункционального агента для элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе или лимфомах различной этиологии.
2). Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, должен содержать статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты – не менее 15 научно- информационных источников за период 2009 – 2014 гг., и патентные исследования оформлены в соответствии по ГОСТ 15.011-96; адресные бифункциональные агенты должны содержать:
а)белковый или пептидный модуль (домен), обеспечивающий специфичное взаимодействие с поверхностным маркером: - аутореактивных лимфоцитов при РС, на основе иммунодоминантных фрагментов аутоантигенов MBP84-106, MBP147-170, MOG35-55 и его пептоидного аналога AMogP3; - молекулы главного комплекса гистосовместимости, ассоциированного с патологией рассеянного склероза HLA_DR2b, Т-клеточного рецептора Ob1.A12, ассоциированного с патологией рассеянного склероза; - раковых лимфоцитов при лимфоме, на основе специфического лиганда рецепторов лимфомных клеток Lymphpep7aaLig;
б) белковый или пептидный модуль (домен), способствующий элиминации: - аутореактивных лимфоцитов при РС, за счет антитело-зависимой цитотоксичности и комплемент-зависимого лизиса на основе рекомбинантного белка константного фрагмента иммуноглобулина (человека и мыши); -аутореактивных лимфоцитов при РС, через трансдуцированные Т-клетки на основе химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII); - раковых лимфоцитов при лимфоме, через трансдуцированные Т-клетки на основе химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII);
структура и чистота экспериментальных образцов адресных бифункциональных агентов должны быть подтверждены современными методами анализа, в том числе:
– масс-спектрометрического анализа полных белковых последовательностей бифункциональных агентов 1а-1г - молекулярная масса анализируемого бифункционального агента не должна отличаться от теоретически рассчитанной более чем на 0.5%;
– масс-спектрометрического анализа триптического гидролизата бифункциональных агентов 1а-1в – идентифицированные пептиды должны составлять не менее 40% от полной последовательности анализируемого бифункционального агента;
– иммуно-ферментного анализа (ИФА) – бифункциональные агенты 1а-1г должны специфически взаимодействовать с анти-видовыми антителами, специфичными к константному домену иммуноглобулинов;
– поверхностного плазмонного резонанса (ППР) – бифункциональные агенты 1а-1г должны специфически взаимодействовать с аутореактивными антителами из пациентов с рассеянным склерозом и модельных мышей, развивающих EAE, с константой взаимодействия KD не менее 1х10-7 моль/литр;
– проточной цитофлуориметрии – Т-клетки, трансдуцированные бифункциональными агентами 2а и 2б, должны специфически взаимодействовать с эпитоп-специфичными анти-MBP моноклональными антителами;
– проточной цитофлуориметрии – Т-клетки, трансдуцированные бифункциональными агентами 2в и 2г, должны специфически взаимодействовать с антителами, специфичными к HLA_DR2b;
– проточной цитофлуориметрии – Т-клетки, трансдуцированные бифункциональным агентом 2д должны специфически взаимодействовать с растворимым HLA_DR2b;
– проточной цитофлуориметрии – Т-клетки, трансдуцированные бифункциональным агентом 3, должны специфически взаимодействовать с растворимым В-клеточным рецептором лимфомных клеток;
– ВЭЖХ-анализа – доля основного пика бифункциональных агентов 1а-1г должна быть не менее 95%;
– ЯМР-анализа – спектр синтезированного пептоида AMogP3 должен соответствовать теоретически предсказанному;
степень очистки экспериментальных образцов адресных бифункциональных агентов должна быть не менее 95% по данным гель-электрофоретического и хроматографического анализов.; содержание бактериальных эндотоксинов в экспериментальных образцов адресных бифункциональных агентов должно составлять менее 10 МЕ/мг (ЛАЛ-тест); экспериментальные образцы адресных бифункциональных агентов должны сохранять стабильность в физиологических условиях в течение не менее 3-х месяцев;
методика получения бифункциональных агентов 1а-1в должна обеспечить выполнение процесса со следующими характеристиками: для бифункциональных агентов 1а-1в и Fc: длительность одного полного цикла выделения и очистки не более 8 часов; количество получаемого целевого продукта за один цикл выделения и очистки не менее 10 мг; выход целевого продукта препарата не менее 60%;
методика получения бифункционального агента 1г должна обеспечить выполнение процесса со следующими характеристиками: среднее молярное соотношение пептоида AMogP3/Fc должно находиться в диапазоне от 1 до 2; длительность одного полного цикла выделения и очистки не более 8 часов; количество получаемого целевого продукта за один цикл выделения и очистки не менее 3 мг; выход целевого продукта препарата не менее 60%;
лентивирусные конструкции, содержащих гены бифункциональных агентов (группы 2 и 3), должны обеспечивать: получение лентивирусов с титром не менее 500 млн. вирусных частиц в 1 мл; уровень трансдукции популяции T-клеток не менее 80% при выживаемости клеток не менее 90%; степень активации трансдуцированных клеток не менее 80%;
экспериментальные образцы адресных бифункциональных агентов 1а-1г должны обеспечить: взаимодействие с эпитоп-специфичными моноклональными антителами с константой взаимодействия KD не менее 1х10-7 моль/литр; активацию системы комплимента с уровнем не менее 30% от уровня активации системы комплимента нативными антителами; уровень элиминации популяции патологических лимфоцитов не менее 80%; фактор избирательности (ESF - доля элиминированных клеток, содержащих специфический маркер патологических клеток к общему количеству клеток, в модельных экспериментах) не менее 100;
экспериментальные образцы адресных бифункциональных агентов 2а-2д, 3 должны обеспечить: уровень элиминации популяции патологических лимфоцитов не менее 80%; фактор избирательности (ESF) не менее 100; а также должны показывать статистически достоверное уменьшение средней кумулятивной и средней максимальной степени развития ЕАЕ в тестах на животных моделях заболевания;
лабораторная методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность адресных бифункциональных агентов in vitro должна обеспечить следующие параметры: взаимодействие с эпитоп-специфичными моноклональными антителами с диапазоном KD от 1х10-5 до 1х10-15 моль/литр; взаимодействие с антивидовыми антителами с пределом обнаружения не менее 10 нг/мл; активацию системы комплимента в диапазоне от 1% до 200% от уровня активации системы комплимента нативными антителами;
уровень элиминации популяции патологических лимфоцитов в диапазоне от 0.1 до 100%; фактор избирательности (ESF) в диапазоне от 1 до 1000.







Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Коллектив разработчиков концентрируется на двух группах социально значимых заболеваниях человека – аутоиммунной нейродегенерацией (рассеянный склероз, РС) и онкологических лимфопролиферативных заболеваниях (лимфомы различной этиологии).
В ходе выполнения исследования будут созданы следующие продукты:
i.MBP84-106-Fc – бифункциональный агент на основе рекомбинантного Fc, слитного с иммунодоминантным фрагментом основного белка миелина человека (MBP84-106); ii.MBP147-170-Fc – бифункциональный агент на основе рекомбинантного Fc, слитного с иммунодоминантным фрагментом основного белка миелина человека (MBP147-170)
iii. MOG35-55-Fc – бифункциональный агент на основе рекомбинантного константного фрагмента иммуноглобулина человека (Fc), слитного с иммунодоминантным фрагментом миелин- олигодендроцитарного гликопротеина человека;
iv. AMogP3-Fc – бифункциональный агент на основе рекомбинантного Fc, химически конъюгированного с пептоидом, взаимодействующим с В-клеточным рецептором аутореактивных лимфоцитов;
v. MBP84-106-CARIII – бифункциональный агент на основе иммунодоминантного фрагмента основного белка миелина человека (MBP84-106) и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII);
vi. MBP147-170-CARIII бифункциональный агент на основе иммунодоминантного фрагмента основного белка миелина (MBP147-170) и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII); vii.MBP84-106-HLA_DR2b-CARIII – бифункциональный агент на основе MBP84-106 в составе молекулы главного комплекса гистосовместимости, ассоциированного с патологией рассеянного склероза (РС), (ГКГС, HLA_DR2b) и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII); viii.MBP147-170-HLA_DR2b-CARIII бифункциональный агент на основе MBP147-170 в составе HLA_DR2b, и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII);
ix. TCR_Ob1.A12-CARIII бифункциональный агент на основе Т-клеточного рецептора Ob1.A12, ассоциированного с патологией РС, и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII);
x. Lymphpep7aaLig-CARIII бифункциональный агент на основе специфического лиганда В- клеточных рецепторов лимфомных клеток различной этиологии и химерного антигенного рецептора Т- клеток третьего поколения (CARIII).
Продукты (i-iv) предназначены для направленной элиминации патологических лимфоцитов за счет антитело-зависимой цитотоксичности и комплемент-зависимого лизиса.
Продукты (v-x) предназначены для направленной элиминации патологических лимфоцитов трансплантацией аутологичных Т-клеток, предварительно модифицированных ex vivo специфическими химерными антигенными рецепторами.
Анализ литературы и рынка коммерчески доступных библиотек пептоидов выявил два основных направления создания и скрининга таких библиотек. Это (i) дифференциальный скрининг с использованием микрочипов и (ii) с использованием библиотеки на микросферах.
С помощью микрочиповых библиотек и технологии дифференциального скрининга были обнаружены специфические пептоиды, связывающие антитела при болезни Альцгеймера. Данный способ позволяет проводить быстрый скрининг библиотеки на выбранный белок- мишень, однако синтез библиотеки требует специального оборудования, что снижает его экономическую привлекательность. Другой способ отбора пептоидов основан на использовании суспензионной библиотеки на микросферах. Данным способом удалось отобрать несколько пептоидов взаимодействующих с VEGFR2, один из которых, GU40C4, связывается в антиген-связывающем центре рецептора и имеет константу связывания KD ~ 30 nM. Описанный выше метод скрининга пептоидных библиотек был реализован компанией RayBiotech, Inc (http://www.raybiotech.com/), при этом предлагается применение ручной системы отбора. Для создания бифункционального терапевтического генно-инженерного конструкта необходимо также рассмотреть наиболее оптимальный цитотоксический агент, способный при направленной его доставке к патологической клетке, обеспечить ее элиминацию. Недавняя работа данного авторского коллектива по скринингу целого ряда токсинов для этих целей позволила остановиться на молекуле рекомбинантного Fc фрагмента антител (Stepanov A. et al., PlosOne. 2011). Этот подход стал крайне актуальным и в мировой литературе появились положительные примеры его применения(Beck A., Reichert J.,mABs, 2011).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Область применения – медицина, фармакология, биотехнология, биохимические исследования, иммунология, онкология.
Областью применения результатов данного исследования является фундаментальная медицина. При проведении ряда организационно-практических мероприятий областью применения может стать практическое здравоохранение РФ. При получении положительных тестов in vivo в рамках предложенной программы исследований целесообразно будет приступить к комплексу доклинических испытаний, в частности на базе центра по доклиническим испытаниям филиала ИБХ РАН в г. Пущино, МО. При получении положительных результатов в рамках данной программы на пост-проектном этапе необходимо будет провести работу по оформлению регистрационных досье, плана клинических испытаний, включая набор центров по прохождению клинических испытаний, и сдать документы на оформление в Минздрав РФ. При получении положительных решений на клинические испытания организовать выпуск препаратов с участием индустриального партнера.
Технология получения бифункциональных агентов позволяет использовать ориентированный на потребителя новейший подход, таким образом, демонстрируя лучшие показатели по сравнению с традиционной таргетной терапией. На протяжении всего использования технология позволит развивать новейшие «под-продукты» таргетные кандидаты препаратов, которые будут более целевыми по отношению к специфичным болезням и субпопуляциям пациентов, а также максимизируют терапевтические эффекты, при этом, минимизируя вред здоровым клеткам. Разрабатываемые технологии имеют высокие перспективы коммерциализации.

Текущие результаты проекта:
1. Анализ литературных данных продемонстрировал, что проблема создания специфического лекарственного средства и его адресной доставки в район патологии далека от своего решения, несмотря на усилия десятков лабораторий, ведущих университетов и крупнейших фармацевтических компаний, стоит особенно остро при разработке терапевтических подходов для лечения рака и аутоиммунных заболеваний. При обеих патологиях терапия призвана элиминировать патологические клетки в организме индивида, при этом нанося минимальный вред его здоровым клеткам. Задача сужается до создания кассетных (бифункциональных) конструкций для осуществления максимально избирательной доставки специфического агента, обеспечивающего элиминацию патологических клеток. Рекомбинантные терапевтические антитела и препаратов используются для лечения злокачественных опухолевых заболеваний и аутоиммунных процессов. Однако в последние годы стало очевидно, что использование в качестве терапевтических агентов непосредственно антител и их конъюгатов имеет определенные ограничения. Современные биоинженерные и клеточные подходы, в частности, рассматриваемые в рамках данного исследования, позволяют создавать эффективные платформы для разработки «таргетных», «персонифицированных» технологий лечения опухолевой трансформации и аутоиммунных процессов.
2. Классификация патентной документации по задачам, решаемым изобретениями в области создания специфических бифункциональных агентов, направленно действующих на патологические клетки, показывает, что большинство изобретений направлено на достижение технических задач по предотвращению роста опухолевых клеток. Наименьшее количество изобретений направлено на уменьшение побочных эффектов лекарственных средств. Таким образом, дальнейшие исследования и практические разработки в области создания специфических бифункциональных агентов, направленно действующих на патологические клетки, являются своевременными и перспективными. Документов, препятствующих использованию способа создания специфических бифункциональных агентов направленно действующих на патологические клетки в ходе поиска не обнаружено.
3. Разработан план исследований, включающий выбор и обоснование направления исследований, сравнительную оценку эффективности возможных направлений исследований. Разработанный план отражает варианты возможных решений задачи, при полном обосновании оптимального варианта решения задач. В плане исследований обоснованы и выбраны методы и средства, направления исследований и способы решения поставленных задач, а также отобраны методы контроля качества разрабатываемых препаратов бифункциональных агентов.
4. Созданы генетических конструкций для экспрессии генов бифункциональных агентов для направленной элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе и лимфоме (группы 1-3 и Fc), а именно:
- разработаны и получены бифункциональные агенты белковой природы на основе рекомбинантного белка константного фрагмента иммуноглобулина (Fc), слитного с пептидами-аутоантигенами, взаимодействующими с В-клеточным рецептором аутореактивных лимфоцитов, для направленной элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе (РС) – MBP84-106-Fc (1а), MBP147-170- Fc (1б), MOG35-55-Fc (1в);
- разработаны и получены бифункциональные агенты на основе пептидов- аутоантигенов отдельно или в комплексе с белками суперсемейства иммуноглобулинов и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII), для направленной элиминации патологических лимфоцитов при рассеянном склерозе в составе лентивирусов – MBP84-106-CARIII (2а), MBP147-170-CARIII (2б), MBP84- 106-HLA_DR2b-CARIII (2в), MBP147-170-HLA_DR2b-CARIII (2г), TCR_Ob1.A12-CARIII (2д);
- разработаны и получены бифункциональные агенты на основе специфического лиганда рецепторов лимфомных клеток различной этиологии и химерного антигенного рецептора Т-клеток третьего поколения (CARIII) для направленной элиминации злокачественных В-клеток (лимфомы) в составе лентивирусов – Lymphpep7aaLig-CARIII (3).
5. С применением автоматического пептидного синтезатора Liberty (CEM Corporation, USA) осуществлён синтез AMogP3 – пептоидного модуля продукта 1г. Продукт успешно очищен до процентного содержания >99% методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Его чистота и соответствие запланированной структуре подтверждены методами ВЭЖХ, капиллярного электрофореза и MALDI масс-спектрометрии.
6. С применением коммерчески доступного бифункционального линкера NHS-PEG2-maleimide получен синтетический конъюгат пептоида AMogP3 с рекомбинантным константным фрагментом иммуноглобулина человека (Fc) в соотношении 2:1.
7. Для получения бифункциональных агентов 1а - 1в были получены клеточные линии-продуценты на основе клеточной линии СНО DG44. С учетом принципов выделения и очистки иммуноглобулинов был разработан метод выделения бифункциональных агентов 1а - 1в. Валидация разработанного метода получения бифункциональных агентов проводилась на примере Fc и MOG-Fc (агент 1а). Было показано, что последовательное применение аффинной хроматографии и ВЭЖХ позволяет обеспечить степень очистки бифункциональных агентов 1а - 1в не менее 95%. Длительность одного полного цикла выделения и очистки составляет 7,5 ч, выход целевого продукта 68%, количество получаемого целевого продукта за один цикл выделения и очистки – 10,2 мг. Подлинность очищенных образцов подтверждена методом масс-спектрометрического анализа.
8. Разработаны методы исследования направленного подавления патологических лимфоцитов бифункциональными агентами (гр. 1 – 3), позволяющие проводить количественную оценку изменения клеточного состава в диапазоне от 0.1 до 100% с коэффициентом избирательности 1-1000 специфической элиминации патологических лимфоцитов препаратами гр. 1 – 3. Эти препараты созданы в рамках выполнения ПНИ по разработке бифункциональных агентов на основе рекомбинантных белков суперсемейства иммуноглобулинов и лигандов поверхностных рецепторов патологических лимфоцитов для направленной терапии лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний.