Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка ускоренной системы идентификации возбудителей внутрибольничных инфекций с одновременным определением их лекарственной устойчивости на основе ДНК-чипов

Номер контракта: 14.607.21.0064

Руководитель: Маянский Николай Андреевич

Должность: Заведующий лабораторным отделом

Организация: федеральное государственное автономное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
внутрибольничные инфекции, грамотрицательные микроорганизмы, генетические детерминанты, β-лактамазы, лекарственная устойчивость, многопараметрический анализ последовательностей днк, биочипы

Цель проекта:
Проект направлен на создание быстрого метода обнаружения антибиотикорезистентных микроорганизмов, вызывающих внутрибольничные инфекции (ВБИ). Тенденция неуклонного роста резистентности к имеющимся антибактериальным препаратам особенно ощутима среди грамотрицательных бактерий. Традиционно используемые методы для их обнаружения и выявления резистентности, основанные на микробиологической идентификации, являются трудоемким, продолжительным и достаточно дорогими. Разработка молекулярного метода одновременной идентификации возбудителей ВБИ и определения их устойчивости к антибиотикам позволит в течение не более 24 часов получить результат, на основании которого будет назначаться адекватная антибиотикотерапия. Точная идентификация детерминант устойчивости поможет устанавливать эпидемиологическую связь между возбудителями ВБИ с целью предотвращения их распространения. Таким образом, целью реализуемого проекта является разработка макета тест-системы для идентификации грамотрицательных микроорганизмов – возбудителей ВБИ с одновременным определением генетических детерминант устойчивости к наиболее эффективным противомикробным препаратам.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе ПНИ должен быть разработан макет тест-системы для ускоренной идентификации возбудителей ВБИ с определением генетических детерминант, определяющих их лекарственную устойчивость к наиболее эффективным бактерицидным препаратам, включая карбапенемы, цефалоспорины третьего поколения и препараты пенициллинового ряда. Метод не подразумевает наличие стадии бактериологического культивирования организмов: в качестве исследуемых образцов должен анализироваться непосредственно клинический материал. Разработанная тест-система должна идентифицировать не менее 9-ти наиболее значимых возбудителей ВБИ и не менее 50 детерминант, определяющих устойчивость к наиболее эффективным препаратам.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В ходе ПНИ должны быть выбраны специальные реагенты (олигонуклеотиды для иммобилизации в ячейках ДНК-чипа и праймеры для амплификации исследуемых фрагментов геномов возбудителей), обеспечивающие идентификацию видоспецифичных нуклеотидных последовательностей в геноме возбудителей, а также определение генов и мутаций, ответственных лекарственную устойчивость. Должны быть выбраны и синтезированы фрагменты ДНК (синтетические фрагменты ДНК), обеспечивающие проверку работоспособности каждого олигонуклеотидного зонда и/или праймера. Для достижения максимальной степени мультиплексности должна быть проведена оптимизация стадии амплификации и флуоресцентного маркирования исследуемых фрагментов геномов.
Должны быть созданы коллекции клинических образов и изолятов актуальных возбудителей в количестве не менее 300 ед., охарактеризованных микробиологическими, биохимическими и молекулярно-генетическими методиками, с целью проведения испытаний тест-системы и специальных реагентов.
Должно быть проведено изготовление и испытания специальных реагентов, с целью включения их в состав комплектов, входящих в макет тест-системы.
Должен быть разработан макет тест-системы, включающие следующие комплекты:
- комплект для амплификации и флуоресцентного маркирования (АМ);
- комплект для гибридизации (ГБ);
- положительный контрольный образец (КО);
- биочипы с иммобилизованными олигонуклеотидами, входящими в состав специальных реагентов.
Должна быть разработана техническая документация на макет тест-системы, в том числе:
- спецификации молекулярных зондов (олигонуклеотидов и праймеров), входящих в состав специальных реагентов;
- спецификация комплекта АМ;
- спецификация комплекта ГБ;
- спецификация комплекта КО;
- чертеж общего вида макета тест-системы (ВО);
- пояснительная записка (ПЗ);
- лабораторный регламент изготовления макета тест-системы.
- проект инструкции по применению тест-системы.
Должны быть проведены в режиме валидации лабораторные испытания макета тест-системы с использованием образцов из созданной в ходе проекта коллекции, с целью оценки диагностических характеристик тест-системы
Макет тест-системы также должен быть апробирован в ходе клинико-лабораторных испытаний в специализированном учреждении здравоохранения РФ, при которых в режиме скрининга должно быть проведено генотипирование исследуемых возбудителей по анализируемым локусам – детерминантам лекарственной устойчивости. Результаты данных испытаний будут использованы для подтверждения диагностических характеристик тест-системы на первом этапе государственной регистрации тест-системы как медицинского изделия для диагностики in vitro в заявке на проведение приемочных технических испытаний – экспертиза предыдущих видов испытаний.
По результатам испытаний должны быть разработаны следующие документы:
- проект Технического задания на ОКР;
- проект методических рекомендаций по использованию тест-системы в клинико-диагностических лабораториях медицинских организаций.
Полученные результаты должны быть отражены в публикациях и патентных заявках.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Разработанная тест-система будет адаптирован для использования в лабораториях любого уровня, имеющего необходимые навыки в проведении стандартной ПЦР. Подразумевается, что наиболее эффективно метод должен использоваться в клинических лабораториях при ЛПУ, в которых проблема борьбы с ВБИ является особенно актуальной. оценка практического применения результатов работы первоначально будет выполнена на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр здоровья детей» (ФГБНУ НЦЗД). Для оценки будут использованы не менее 300 образцов клинического материала, полученных из различных отделений лечебного учреждения, что позволит уточнить спектр клиник, в которых тест-система может применяться наиболее эффективно. В дальнейшем планируется провести клиническую апробацию системы в клинических лабораториях 5-ти лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), в первую очередь, тех, кто уже обратился с подобным запросом к Участнику, и обладает необходимой материально-технической базой и квалифицированными кадрами. По результатам оценки использование тест-системы может быть рекомендовано не только учреждениям МЗ РФ, но и специализированным учреждениям, входящих в состав ФСИН, МО, МЧС, ФМБА, а также в частные коммерческие лаборатории.

Текущие результаты проекта:
Целью 2-го этапа проекта являлась разработка комплекта реагентов для амплификации и экспериментальной модели ДНК-чипов с иммобилизированными олигонуклеотидными зондами на основе информации о характеристиках биологических объектов (ДНК и бактериальных изолятов) из создаваемых коллекций чистых культур возбудителей ВБИ и образцов их ДНК. Методология проведения работы включала в себя отбор генетических маркеров, обеспечивающих идентификацию возбудителей и генетических детерминант, определяющих их лекарственную устойчивость, расчет оптимальных зондов для идентификации выбранных генетических маркеров на основе оценки устойчивости образующихся совершенных и несовершенных дуплексов, экспериментальная проверка выбранных зондов с использованием как синтезированных фрагментов ДНК, так и амплифицируемых участков генов возбудителей болезней. В ходе выполнения работ на 2 этапе ПНИ было начато создание коллекции образцов ДНК бактериальных патогенов – вобудителей ВБИ (депонировано 302 образца ДНК). Продолжился сбор клинических образцов и получение на основе выделенных штаммов чистых культур возбудителей ВБИ с их последующей идентификацией фенотипическими и протеомными методами и определением резистентности изолированных чистых культур с помощью фенотипических методов. Был разработан комплект реагентов для амплификации (АМ), обеспечивающий амплификацию и флуоресцентное маркирование целевых фрагментов генома с целью идентификации возбудителей ВБИ и молекулярных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам. Проведена экспериментальная проверка олигонуклеотидов и праймеров АМ. Составлена спецификация на комплект АМ. Проведена иммобилизации олигонуклеотидов из числа молекулярных зондов специальных реагентов (СР) на подложках и изготовлены экспериментальные серии ДНК-чипов (всего 720 единиц). Проведены испытания СР в соответствии с Программой и методиками испытаний, достигнуты целевые значения чувствительности, специфичности, воспроизводимости. Продолжено создание и поддержание коллекции микроорганизмов, полученных из биологического материала, для контроля аналитических характеристик макета тест-системы, в ее состав на 2 этапе добавлено 322 штамма возбудителей ВБИ. Осуществлен синтез праймеров для характеристики коллекции образцов ДНК (всего 32 единицы). Описаны технические требования и предложения по разработке и производству Тест-системы. Комплект специальных реагентов (СР), разработанный в ходе ПНИ, которые обеспечивают идентификацию возбудителей ВБИ и молекулярных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам, выдержал испытания в соответствии с Программой и методикой испытаний. Были достигнуты целевые значения всех трестировавшихся параметров. Изготовлена экспериментальная серия биологических микрочипов для идентификации возбудителей ВБИ и молекулярных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам. Серия включала два типа биологических микрочипов: 1) для идентификации возбудителей ВБИ (n=350), содержащих 12 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов и 2) для идентификации молекулярных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам (n=370), содержащих 55 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов. Таким образом, полученные результаты полностью соответствуют требованиям к выполняемому проекту.