Регистрация / Вход
Прислать материал

Аналитическая система для персонифицированной идентификации биомаркеров, обуславливающих чувствительность к онколитической биотерапии

Аннотация скачать
Ключевые слова:
идентификация биомаркеров, злокачественные заболевания, транскриптомный анализ, сигнальные пути, врожденный иммунитет, интерфероновая система, онколитический вирус, терапевтические микроорганизмы, противоопухолевая терапия, метастазирование, репликация вирусов, повышение эффективности терапии, предсказание эффективности терапии, персонифицированная медицина, ксенографты опухолей человека, органная культура, культура клеток

Цель проекта:
Проект направлен на повышение эффективности и предсказуемости биотерапии при лечении наиболее распространенных форм злокачественных заболеваний - рака легкого, простаты, молочной железы, толстого кишечника, шейки матки. Целью проекта является создание на основе постгеномных технологий аналитической системы по поиску и идентификации биомаркеров онкологических заболеваний, по которым возможно предсказание индивидуальной чувствительности опухоли к онколитической биотерапии и осуществлять подбор наиболее эффективного для конкретного пациента терапевтического штамма онколитических вирусов. Создание такой системы позволит прогнозировать эффективность применения биотерапевтических онколитических штаммов с учетом индивидуальных особенностей опухоли конкретного пациента, проводить персонифицированный подбор оптимального курса онколитической биотерапии, а также разрабатывать новые онколитические препараты, обладающих более широким спектром противоопухолевого действия. Выявление новых биомаркеров будет проводиться на основе транскриптомного анализа опухолей по технологии NGS, с подтверждением и верификацией результатов с помощью высокопроизводительного протеомного анализа. После получения массива данных о представленности транскриптов всех генов индивидуальных опухолей будет проводиться биоинформатический анализ с целью выявления изменений в сигнальных путях, ответственных за противовирусную защиту клетки (включая способность опухолевых клеток индуцировать интерфероны в ответ на вирусную инфекцию и способность реагировать на обработку интерферонами и формировать невосприимчивость к вирусной инфекции), а также об экспрессии других генов, влияющих на способность вирусов заражать и убивать клетки. Путем анализа большого числа опухолей различного происхождения будут выявлены новые биомаркеры, проведено подтверждение их влияния на восприимчивость к ряду онколитических вирусов в модельных системах in vitro (культурах опухолевых клеток с модификацией экспрессии испытуемых биомаркеров), и in vivo (на моделях ксенографтов опухолей человека в иммунодефицитных мышах). Будут разработаны алгоритмы выбора оптимальной персонифицированной онколитической терапии конкретного пациента. Проект также предполагает экспериментальную отработку принципиально нового подхода к преодолению формирования устойчивости злокачественных клеток к применяемой терапии, который использует генетическую конкуренцию эволюционирующих под действием терапии опухолевых клеток и онколитических вирусов, эволюционирующих в опухоли в сторону приобретения способности размножаться на ранее нечувствительных к вирусу опухолевых клетках. Установление возможности внутриопухолевой адаптации терапевтических вирусов откроет возможность для создания инновационных методов преодоления проблемы приобретенной устойчивости опухолей к терапии. Повышенная восприимчивость опухолевых клеток к онколитической биотерапии обусловлена как повышенной экспрессией факторов, способствующих проникновению вируса в клетки и его успешному размножению, так и утратой систем врожденного противовирусного иммунитета. Молекулярные изменения, придающие клеткам чувствительность к биотерапии могут служить биомаркерами, на основании которых можно предсказывать успех применения того или иного терапевтического штамма. Для идентификации наиболее характерных мишеней подвергающихся инактивации в различных типах опухолей требуется анализ множества клинических случаев, с последующим секвенированием транскриптома и биоинформатическим анализом. После установления этих мишеней дальнейший анализ образцов конкретных пациентов можно будет проводить путем ПЦР в реальном времени, или иммунологических тестов, что значительно ускорит и удешевит установление восприимчивости клеток к вирусам. Решение проблемы выбора оптимального варианта биотерапии у конкретного пациента станет возможным после последовательного решения ряда задач: - Формирование обширной коллекции опухолевого материала от пациентов, страдающих наиболее распространненными формами онкологических заболеваний. Забор материала производится во время хирургической операции или получения биопсии. Опухолевый материал оперативно консервируется для обеспечения сохранности жизнеспособности клеток (криоконсервация в специальной среде дезинтегрированной ткани) и молекул РНК и ДНК (с применением фиксирующего реагента RNAlater). - Выделение препаратов мРНК и проведение секвенирования транскриптома опухолей. Оптимизация режимов секвенирования для количественного определения интенсивности транскрипции генов компонентов, участвующих во взаимодействии патогена и клетки, а также состояния компонентов врожденного противовирусного иммунитета, систем реакции клеток на стрессы, систем поддержания стабильности генома, компонентов сигнальных путей, ответственных за контроль пролиферации клеток и клеточную смерть. - Проведение биоинформатического анализа и сравнение транскриптома ряда опухолей, имеющих общее тканевое происхождение с целью выявления закономерностей изменения транскрипции, идентификации изменений значимых для взаимодействия клеток с вирусными патогенами. - Отработка алгоритмов анализа транскриптом опухолевых клеток, с учетом тканевой принадлежности опухоли. - Разработка процедуры культивирования фрагментов опухолей различного гистогенезиса в органных культурах, позволяющую сохранять жизнеспособность клеток в течение 3-5 дней. Оптимизация условий для оптимального тестирования эффективности репликации онколитических вирусов. - Оценка способности панели онколитических штаммов размножаться и убивать клетки опухоли в органной культуре. Определение взаимосвязи между экспрессией поверхностных рецепторов клетки, необходимых для проникновения вирусов, а также состояния противовирусных сигнальных путей и способности опухолевых клеток размножать вирусы. - Верификация данных о влиянии новых биомаркеров на чувствительность к вирусам на модельных культурах клеток нескольких типов рака, имеющих вариации в экспрессии тестируемых биомаркеров. - Формирование перечня предсказательных биомаркеров, пригодных для подбора оптимально-эффективных для конкретного пациента терапевтических штаммов, на основании анализа экспрессии выявленных биомаркеров и данных по чувствительности к вирусам - Разработка диагностических тестов на основе ПЦР в реальном времени, которые позволят оперативно количественно определять экспрессию биомаркеров чувствительности к биотерапии. - Разработка принципов и подходов для оперативной адаптации онколитических вирусов к гетерогенной по чувствительности к вирусам опухоли пациента. Определение путем секвенирования вирусов, прошедших пассирование на экспериментальной смешанной опухоли, возможность их изменения в сторону приобретения тропизма к ранее нечувствительным типам клеток. Полученные результаты будут представлять совершенно новый подход к лечению рака, решающий проблему приобретенной устойчивости к терапии.

Основные планируемые результаты проекта:
В результате успешного выполнения проекта будут созданы инновационные технологии, которые позволят:
Выявлять новые биомаркеры злокачественных заболеваний, коррелирующие с чувствительностью к онколитической биотерапии.
Проводить оперативный анализ индивидуальных особенностей опухоли конкретного пациента с целью подбора наиболее эффективного варианта онколитической биотерапии.
Разработка алгоритмов для анализа транскриптома опухолей различного гистогенеза и формирование оптимальных ПЦР тестов позволит осуществлять быстрое определение чувствительности опухоли пациента в панели онколитических вирусов и подбирать оптимальный для пациента набор терапевтических штаммов.
Будут созданы панели онколитических вирусов с расширенным спектром воздействия на опухоли различного типа и разработаны рекомендации по их последовательному применению с целью увеличения длительности терапевтического воздействия, повышающего вероятность полного удаления опухолевых клеток из организма больного.
Будет проведена экспериментальная верификация подхода по применению «самонацеливающихся» онколитических вирусов, что откроет перспективу для разработки новых терапевтических штаммов на основе вирусов с нестабильным геномом, которые смогут преодолеть проблему возникновения невосприимчивости к терапии и последующих рецидивов заболевания.
Аналитическая система будет запатентована, по результатам исследований будут опубликованы статьи в научных журналах, представлены сообщения на научных симпозиумах.
По окончании работы будет разработано технико-экономическое обоснование применения разработанной технологии в условиях клиник, сформулированы технические требования и предложения по ее эксплуатации индустриальным партнером.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате проведенной работы будет разработано несколько диагностических тестов на основе новых выявленных биомаркеров, которые позволят подбирать оптимальную для пациента схему лечения онколитическими вирусами. С применением этих тестов будет существенно повышена эффективность терапии онколитическими вирусами, что важно как для проведения успешных клинических испытаний новых штаммов онколитических вирусов (подбор пациентов для испытания будет производиться на основании молекулярно-генетических особенностей их опухолей), так и для эффективности терапии в клинике.
Кроме разработки аналитической тест системы и конкретных диагностических тестов проект предусматривает выяснение возможности создания самонацеливающихся онколитических вирусов которые за счет быстрой изменчивости смогут адаптироваться к мутирующим опухолевым клеткам, приобретающим нечувствительность к исходному вирусному штамму.
Создаваемая аналитическая система для поиска биомаркеров чувствительности к онколитической биотерапии пока не имеет мировых аналогов. Несмотря на наличие многочисленных разработок и испытаний ряда перспективных штаммов онколитических вирусов задачи предсказания эффективности таких штаммов у конкретного пациента никто ранее не ставил. Поэтому результаты проводимой работы будут иметь приоритетное значение.
Задача анализа больших массивов транскриптомной информации из образцов опухолей пациентов решается с помощью биоинформатических методов. Известно, что противовирусные механизмы повреждаются при злокачественных заболеваниях очень часто, что приводит к приобретению чувствительности к вирусам. Однако поломка в конкретных звеньях противовирусных сигнальных путей может влиять на репликацию отдельных семейств вирусов по разному. Задачей проекта является сопоставление выявленных конкретных нарушений с реальными изменениями чувствительности опухолевых клеток к различным представителям онколитических вирусов. Путем достижения ответа на вопрос о возможности самонацеливания вирусов является выяснение скорости изменчивости вируса при культивировании в смешанных опухолях, содержащих чувствительные и нечувствительные к вирусу клетки. После таких пассирований вирус будет проверяться на возможность репликации на ранее нечувствительной культуре и подвергаться секвенированию. Выбранная схема позволяет с уверенностью рассчитывать на возможность выяснения поставленного вопроса. В случае обнаружения недостаточности скорости изменчивости вируса для преодоления невосприимчивости планируется использование разрабатываемых нами РНК-мутагенов, которые избирательно влияют на изменчивость РНК-содержащих вирусов и не влияют на качество транскриптов клетки-хозяина.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Аналитическая система для персонифицированной идентификации биомаркеров, обуславливающих чувствительность к онколитической биотерапии предназначена для применения в медицинских учреждениях подбора персонифицированной биотерапии злокачественных заболеваний конкретного пациента.
Онколитическая биотерапии до сих пор в нашей стране не дошла до клиники, что обуславливается, в частности, непредсказуемостью лечебного эффекта, вызванного индивидуальными особенностями опухолей. Однако, в 2015 году в США был одобрен к клиническому применению первый штамм онколитического вируса герпеса. В самой ближайшей перспективе будет внедрено более десятка штаммов, находящихся на заключительных этапах клинических испытаний. Два препарата утверждены к применению в клинике в Латвии и Китае. В России также ведеутся создание онколитчиеских штаммов на основе нескольких семейств онколитических вирусов. По оценкам специалистов онколитическая терапия рака в ближайшее десятилетие может занять ведущее место в онкологической практике, существенно потеснив цитотоксическую химиотерапию. В связи с эти проводимые нами разработки исключительно актуальны и будут востребованы как в России, так и зарубежом. Ее внедрение позволит с большой точностью предсказывать терапевтический ответ, что выведет онколитическую биотерапию на качественно новый уровень.
После успешного завершения проекта созданная аналитическая система, новые выявленные биомаркеры, тесты основанные на них, а также новые варианты онколитических вирусов будут предметом для доклинических и клинических испытаний. В поддержке таких исследований значительную заинтересованность проявляет «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава РФ и НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. Индустриальный партнер - НПО «Микроген» заинтересован в налаживании производства препаратов на основе разрабатываемых онколитических вирусов, а также реагентов для диагностики восприимчивости опухолей к биотерапии.
В ходе реализации задач проекта в ИМБ РАН будет существенно усилена материально-техническая база для фундаментальных исследований проблем вирусного онколиза, а также для проведения доклинической фазы испытаний терапевтических и диагностических препаратов.


Текущие результаты проекта:
В ходе выполнения работ, запланированных на 2015 год (Этапы 2 и 3) получены следующие результаты:
Разработаны методики криопрезервации органных культур злокачественных опухолей человека. Произведен сбор биологических образцов биоптатов злокачественных опухолей человека (рак молочной железы, рак легкого, рак простаты, рак поджелудочной железы, злокачественные глиомы мозга) и сформированы коллекции криопрезервированных образцов. Отработаны методики секвенирования транскриптом клеток злокачественных опухолей человека для количественного определения интенсивности транскрипции генов, принимающих участие во взаимодействии патогенов и клетки. Отработаны алгоритмы биоинформатического анализа транскриптом клеток злокачественных опухолей человека с учетом тканевой принадлежности опухоли для идентификации биомаркеров чувствительности клеток к штаммам онколитических вирусов исходной панели и алгоритмы для вычитания транскриптов стромы опухоли. Разработаны методики культивирования фрагментов злокачественных опухолей человека в органных культурах. Проведено параллельное секвенирование транскриптома 203 биологических образцов злокачественных опухолей пациентов. Изучена избирательная способность 15 штаммов онколитических вирусов размножаться и убивать модельные культуры злокачественных опухолей человека. Разработана методика оценки онколитической активности исходных 15 штаммов онколитических вирусов из исходной панели в органной культуре злокачественных опухолей человека. Разработана методика оценки изменчивости и проведен выбор штаммов для создания экспериментальной панели из 5 штаммов онколитических вирусов для проведения опытов по внутриопухолевой изменчивости. Проведено усовершенствование алгоритма выявления биомаркеров чувствительности клеток к штаммам онколитических вирусов исходной панели. Разработан лабораторный регламент получения экспериментальной панели самонацеливающихся штаммов онколитических вирусов. Проведение анализ транскриптом опухолевых клеток с учетом тканевой принадлежности опухоли для идентификации биомаркеров чувствительности клеток к штаммам онколитических вирусов исходной панели. Получены рекомбинантные лентивирусные конструкции, экспрессирующие кДНК выявленных биомаркеров, для гиперэкспрессии выбранных биомаркеров в модельных линиях клеток злокачественных опухолей человека. Получены рекомбинантные лентивирусные конструкции для РНК-интерференции и подавления экспрессии выявленных биомаркеров в модельных линиях клеток злокачественных опухолей человека. Получены модельные культуры клеток злокачественных опухолей с измененной экспрессией выявленных биомаркеров.