Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
антибиотик, ингибитор, рибосома, синтез белка, бактерия, трансляция, репортерный штамм, скрининг, автоматизация, флюоресцентный белок

Цель проекта:
Для эффективного поиска антибиотиков с одновременным эффективным и дешевым определением механизма их действия необходима система автоматизации, позволяющая вместе с обнаружением антибактериальной активности сразу идентифицировать те соединения, которые действую на определенную мишень, в данном случае, систему биосинтеза белка. Цель проекта: Разработка системы поиска антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме.

Основные планируемые результаты проекта:
Должны быть получены:
-Отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
- Экспериментальные образцы набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка;
- Лабораторный технологический регламент изготовления набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка;
- Инструкция по применению набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка;
- Программа для ЭВМ автоматизированного тестирования потенциальных антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка;
- Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации системы поиска антибактериальных препаратов–веществ ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера-организации реального сектора экономики (ЗАО "Исследовательский Институт
Химического Разнообразия");
- Проект технического задания на проведение ОКР по теме: "Широкомасштабный скрининг антимикробных препаратов, ингибиторов биосинтеза белка"

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения проекта будет разработана автоматизированная система скрининга ингибиторов биосинтеза белка.
Основные характеристики разрабатываемой системы:
-Разрабатываемая Система должна позволять проводить анализ не менее 96 образцов на одной агаризованной чашке.
-Производительность разрабатываемой системы должна быть не ниже 900 образцов в сутки.
-Тестирование должно проводиться с помощью роботизированной системы, например Janus (Perkin-Elmer) или Biomek (Beckman) или аналогичной, оснащенной 96-канальной пипетирующей насадкой.
-Должно быть проведено тестирование не менее 10 000 органических химических соединений.
Система будет основана на репортерном штамме, способном сигнализировать о ингибировании продвижения рибосомы. Обычно, применяющиеся высокопроизводительные системы основаны на модельных реакциях in vitro, которые как правило дороги и требуют сложных схем пипетирования. Разрабатываемая система будет требовать минимального количества пипетирований и не будет требовать дорогих реактивов. С помощью разработанной системы будет проведен тестовый скрининг большой выборки соединений, предоставленной индустриальным партнером.
Аналогичные работы за рубежом ведутся, как уже отмечалось, с использованием дорогостоящих систем, основанных на модельных реакциях. Репортерные штаммы, разработанные за рубежом не обладаю теми позитивными характеристиками, которыми обладает созданный нами штамм. Аналогичные системы способны реагировать на предопределенные узкие классы известных антибиотиков и не способны выявлять новые классы соединений, объединенных мишенью - процессом биосинтеза белка.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
В результате выполнения проекта будет выполнена разработка и тестирование автоматизированной
системы поиска антибактериальных препаратов, ингибиторов биосинтеза белка. Эта система будет
применяться научно-исследовательским сообществом и фармацевтическими компаниями для поиска
новых антибактериальных препаратов с заранее известной мишенью действия. Прогноз развития рынка
высокопроизводительного скрининга в мире составляет 19,6 миллиарда долларов. Из них примерно 6%
тратится на поиск новых антибактериальных препаратов. В настоящее время стандартный путь разработки
включает в себя скрининг на антибактериальную активность, а затем, дорогостоящий и сложный поиск
мишени антибактериального препарата. Без установления мишени невозможно внедрение препарата.
Разрабатываемая система скрининга позволит уже на первом этапе и без дополнительных затрат выявлять
не только собственно антибактериальную активность, но и сразу определять те вещества, которые
действуют на биосинтез белка. Это ускорит процедуру поиска потенциальных антибиотиков. Кроме того,
разрабатываемая система позволит находить новые классы соединений, действующих на биосинтез белка,
что имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов этого биологического процесса.
Механизмы ингибирования биосинтеза белка вызывают большой интерес у Российского и
международного научного сообщества и служат основой для многочисленных публикаций в
высокорейтинговых научных журналах. Таким образом, разрабатываемая система будет востребована как
учеными, занимающимися процессом биосинтеза белка, так и фармацевтической промышленностью,
проводящей разработку и внедрение антибактериальных препаратов.

Текущие результаты проекта:
Исследован созданный набор репортерных штаммов на основе генов флюоресцентных белков RFP и CER. Основываясь на полученных ранее результатах, мы отказались от использования репортерных конструкций на основе генов люцифераз светлячка и коралла. Ранее мы показали, что репортерные штаммы на основе этих конструкций требуют использования дорогостоящих реагентов – субстратов люцифераз. Кроме того, эти штаммы не подходят для использования при нанесении на агаризованные чашки. Этих недостатков лишены репортерные штаммы, созданные с использованием генов флюоресцентных белков. Мы сравнили созданный нами ранее штамм на основе триптофанового оперона pRFPCER-TrpL2A со штаммами, созданными на основе других аттенюаторов (pRFPCER-PheMST, pRFPCER-HisLGDCBHAFI, pRFPCER-IlvLXGMEDA), промоторов (pRFPCER-pdhRaceEF, pRFPCER-gadAX, pRFPCER-SulA) и РНК-сенсоров (pRFPCER-IbpAB, pRFPCER-CspA). Конструкции были протестированы в присутствии антибиотиков, ингибирующих биосинтез белка и контрольных. Лучше всего показали себя конструкции на основе мутированного триптофанового аттенюатора. При этом оптимальным и соответствующим требованиям технического задания оказался штамм ΔtolC, трансформированный плазмидой pRFPCER-TrpL2A. Репортерные штаммы на основе других регуляторных элементов не показали нужной селективности к ингибиторам биосинтеза белка.
Для высокопроизводительного тестирования потенциальных антибактериальных препаратов –веществ-ингибиторов биосинтеза белка была разработана программа для ЭВМ. Мы использовали высокопроизводительную роботизированную станцию Janus (Perkin-Elmer), находящуюся в центре коллективного пользования МГУ. Роботизированная станция управляется программой WinPREP, позволяющей создавать программные инструкции (т.н. скрипты) и интерпретировать их. На языке программирования MultiPROBE II WinPREP Protocol Script была создана программа, управляющая роботизированной станцией.
В соответствии с требованиями технического задания нам необходимо было сформировать программу и методики испытания требуемых параметров системы. Приказом по подразделению федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (химическому факультету) номер 329 от 19 мая 2015 года была учреждена комиссия по проведению исследовательских испытаний системы поиска антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка. Программа и методики испытаний, принятые комиссией и утвержденные руководителем подразделения заказчика под названием ИНГ.Б.Б.1 прилагаются к отчету отдельным документом.
Согласно требованиям технического задания был разработан состав набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов – веществ –ингибиторов биосинтеза белка и лабораторный технологический регламент его изготовления.
В состав набора вошли: реакционная плашка для нанесения образцов соединений 1 шт. (Условия хранения +4 oC), питательная среда, 1 мл (Условия хранения +4 oC), репортерный штамм, 1 мл (Условия хранения -20 oC), эртитромицин (положительный контроль) 20 мкл (Условия хранения -20 oC), левофлоксацин (отрицательный контроль) 20 мкл (Условия хранения -20 oC).
В полном соответствии с созданным регламентом на Химическом факультете федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" было создано 10 экспериментальных образцов набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов –веществ-ингибиторов. Факт изготовления 10 образцов набора подтвержден актом комиссии по проведению исследовательских испытаний (ИНГ.Б.Б.1) набора для тестирования потенциальных антибактериальных препаратов – веществ-ингибиторов биосинтеза белка.
Успешно реализованы мероприятия по достижению технико-экономических показателей технического задания.