Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов

Номер контракта: 14.607.21.0093

Руководитель: Летаров Андрей Викторович

Должность: заведующий лабораторией вирусов микроорганизмов

Организация: Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Организация докладчика: Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
бактеориофаг, вирусоподобная частица, сибирская язва, bacillus anthracis,протективный антиген, вакцина, диагностика, токсин-нейтрализация, бласт-трансформация

Цель проекта:
1. На примере протективного антигена Bacillus anthracis должен быть разработан подход по модификации антигенов, который может быть использован для повышения эффективности иммунобиологических препаратов вакцинного назначения. 2. Необходимо создать прототип иммунобиологического препарата на основе протективного антигена B. anthracis с генно-инженерными модификациями (слияние со структурными белками бактериофагов), которые позволяют формировать вирусоподобные частицы и за счет этого направленно регулировать силу и специфичность иммунного ответа. 3. Необходимо изучить иммуногенность полученного антигена и оценить возможность его применения для конструирования вакцин.

Основные планируемые результаты проекта:
I. Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности).
Впервые с помощью рекомбинантных штаммов наработан протективный антиген в форме слитых белков, образующих вирусоподобные (фаговые) частицы, не уступающие по иммуногенности природным вирионам. Методические подходы, лежащие в основе технологии фагового дисплея, позволят на следующем этапе работ получить вирусоподобные частицы, несущие на своей поверхности заданные антигенные детерминанты и крупные белковые домены, являющиеся антигенами. Впервые такие конструкты будут использованы как в диагностических целях (например, в иммуно-ферментном анализе), так и в качестве вакцинных препаратов.

II. Основные характеристики планируемых результатов, научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Разработка дизайна искусственного гена белка протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli в составе частиц бактериофагов с применением методов предсказания пространственной структуры белка.
2. Разработка дизайна искусственного гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli в составе частиц бактериофагов.
3. Создание искусственного гена протективного антигена B. anthracis и проверка аутентичности его структуры.
4. Получение экспрессионной конструкции на основе искусственного гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в E. coli.
5. Разработка дизайна искусственного слитого протективного антигена B. anthracis адаптированного для экспрессии в фаговых частицах.
6. Создание искусственного слитого гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в фаговых частицах.
7. Получение экспрессионной конструкции на основе искусственного гена искусственного слитого гена протективного антигена B. anthracis, адаптированного для экспрессии в форме фаговых частиц.
8. Выделение и биологическая характеристика новых бактериофагов, обладающих патентной чистотой, которые могут быть использованы при дальнейшем развитии разрабатываемой технологии в качестве векторов для поверхностного дисплея антигенов и/или источника генов полимеризующихся структурных белков.
9. Подбор или селекция родительских штаммов E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis.
10. Отработка условий культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающих максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме.
11. Получение экспрессионных векторов для наработки полимеризующихся белков фагов
12. Создание гибридных белков на основе полимеризующихся структурных белков и протективного антигена B. anthracis.
13. Исследование возможности получения вирусоподобных частиц на основе созданных химерных белков и исследование их физико-химических свойств.
14. Оптимизация метода получения вирусоподобных частиц и подбор условий их очистки.
15. Отработка способа получения вирусоподобных частиц с помощью инфекции бактериофагом - помощником, обеспечивающего максимальный выход слитого белка-антигена протективного антигена B. anthracis в форме фаговых частиц.
16. Создание тест-системы для количественной оценки уровня накопления в слитого белка-антигена протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli.
17. Создание тест-системы для количественной оценки уровня накопления в форме фаговых частиц.
18. Отработка условий получения фаговых лизатов E.coli, обеспечивающих сохранность рекомбинантного протективного антигена B. anthracis.
19. Отработка условий бесколоночной очистки фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
20. Отработка условий гель-фильтрации фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
21. Наработка экспериментального образца фаговых частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
22. Экспериментальная иммунизация животных иммунобиологическим препаратом на основе фаговых частиц.
23. Оценка иммуногенности иммунобиологических препаратов in vitro в реакции бласт-трансформации лейкоцитов с оценкой результата с помощью ПЦР в реальном времени.
24. Оценка иммуногенности иммунобиологических препаратов in vivo по уровню продукции токсин-нейтрализующих антител.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать пожизненный иммунитет привитых животных. Выполнение данного проекта ведет к созданию конечного продукта - прототипов субъединичных рекомбинантных вакцин для специфической профилактики крупного рогатого скота и северного оленя от сибиреязвенной инфекции. Кроме того, будут разработаны системы контроля качества (соотношения иммуногенной активности и реактогенности) для производства перспективных рекомбинантных вакцин для специфической профилактики сибиреязвенной инфекции.
Практическая опасность возникновения сибиреязвенной инфекции для человека незначительна. Тем не менее, будучи в эпидемиологическом отношении типичным зоосапронозом, возбудитель этого заболевания сохраняется и будет сохраняться в природе, периодически вызывая спорадическое инфицирование домашних животных. Поскольку сибиреязвенная инфекция классифицируется как особо опасное заболевание для человека и животных, даже единичный её случай влечёт за собой масштабные и дорогостоящие карантинные мероприятия, существенно нарушающие планомерность хозяйственной деятельности. С учётом этого применение средств профилактики сибирской язвы на животноводческих фермах приобрело повсеместный характер и является важнейшим фактором снижения себестоимости продукции, а также обеспечения ее конкурентоспособности в условиях быстрого роста производства. В еще большей мере это касается северного оленя, максимально соприкасающегося с природными резервуарами сибирской язвы. В соответствии с действующим ветеринарным законодательством (Ветеринарные правила ВП 13.3.1320-96) вакцинация животных против сибирской язвы входит в число обязательных мероприятий на угрожаемых территориях. На практике вакцинации подвергаются большинство сельскохозяйственных животных. Это обуславливает широкий и стабильный рынок сибиреязвенных вакцин.
В РФ производятся и применяются убитые вакцины против сибирской язвы на основе вакцинных штаммов Bacillus anthracis. Основным производителем ветеринарной вакцины этого типа является Орловская биофабрика. Крупным недостатком этой вакцины является отсутствие в ней наиболее важного антигена B. anthracis – сибиреязвенного токсина, антитела против которого обеспечивают полную защиту от максимальных доз инфекционного агента и отличаются длительным сроком циркуляции. В результате вакцины обеспечивают лишь кратковременную (не дольше 6 мес.) выработку антител, в основном, против полисахарида клеточной стенки бацилл. За счёт использования адъювантов и разработки внутрикожного метода введения удается поднять длительность циркуляции антител до 12 мес., однако, протективность такого иммунного ответа в случае возникновения вспышки остается под вопросом. Недостатком существующей вакцины является и необходимость использования при ее производстве вакцинного штамма Bacillus anthracis, относящегося к I группе патогенности, что влечет за собой крупные затраты на обеспечение режима безопасности на производстве.
Важным преимуществом рекомбинантных вакцин по сравнению с традиционными является отсутствие в их составе биологически опасных бактерий и вирусов, а также продуктов их жизнедеятельности, и при этом вызывают иммунный ответ узкой специфичности. Кроме того, исключаются трудности выращивания вирусов, хранения и возможности репликации в организме вакцинируемого в случае использования живых вакцин. Вместе с тем, убедительно доказано, что субъединичные вакцины на основе растворимых антигенов уступают по иммуногенности цельновирионным, хотя природа повышенной иммуногенности антигена, имеющего наноразмерную корпускулярную структуру остается неизвестной. Доступным способом решения этой проблемы является получение рекомбинантных антигенов в форме слитых белков, образующих псевдовирусные (фаговые) частицы, не уступающие по иммуногенности природным вирионам.
Получение рекомбинантных белков является типовой задачей, лежащей в основе многих биотехнологических проектов. Со времен появления модели лактозного оперона Жакоба и Моно молекулярные биологи и биотехнологи исходят из представления, что регуляции экспрессии гена осуществляется на уровне промотора и не зависит от структуры кодируемого белка. Эта модель вполне удовлетворительно описывает механизм регуляции работы генов в естественном окружении, но мало пригодна для создания продуцентов гетерологичных и, особенно, искусственно сконструированных белков. Общеизвестно, что использование даже самых современных и мощных бинарных промоторных систем, например, на основе промотора Т7, не дает гарантии детектируемого выхода продуктов слитых или укороченных производных природных генов. Еще реже удается добиться экспрессии in vivo полностью синтетических искусственных генов. Известно, что системы шаперонов бактериальной клетки in vivo способны оценивать способность продукта к формированию компактной глобулярной структуры. Продуктивным подходом к конструированию эффективных продуцентов гетерологичных белков является обеспечение их способности к формированию устойчивой глобулярной структуры непосредственно в процессе трансляции. Этому может способствовать создание химерных конструкций с надлежащими скафолдными белками, а также разделения доменов белков. Современные принципы предсказания доменной структуры и рационального дизайна искусственных белков на этой основе, включающие общедоступные компьютеризованные сервисы, описаны в работе (Huang, 2013). Современные методы скрининга описаны в работе (Listwan, 2009). В рамках настоящего проекта для минимизации антигена планируется использование обоих способов.
Существует несколько возможностей для экспозиции антигенов на фаговых и фагоподобных белках. В последние десятилетия предложены ряд векторов для дисплея пептидов на нитчатых (фаг М13) и хвостатых фагах (фаг Т7, имеются также работы по дисплею на Т4). При разработке субъединичных вакцин необходимо учитывать собственную иммуногенность фаговых частиц. Так, крупные хвостатые бактериофаги эффективно секвестрируются лимфоидными тканями печени и селезенки и инактивируются ретикулоэндотелиальной системой (см. обзор Летаров с соавт. 2010). Как сами бактериофаги, так и их очищенные белки, могут вызывать достаточно эффективный антительный ответ при введении без адъювантов, нитчатые фаги обладают значимо меньшей собственной иммуногенностью (Gachechiladze 2005). Это было продемонстрировано также на модели высокоочищенных препаратов частиц фага Т4 и белков его головки, которые выполнялись с участием заявителей (Miernikiewicz et al, 2012, 2013). Таким образом, фаговые частицы и фагоподобные частицы, полученные из фаговых структурных белков могут выполнять функцию адъюванта, эффективно направляющего пептиды вирусных антигенов в антиген-презентирующие клетки иммунной системы. Варьируя тип и/или последовательность фаговых белков можно управлять иммуногенностью представленных на них пептидных антигенов.
Решение задачи по вычленению доменов в составе белков, структура которых неизвестна по причине их недоступности в очищенном состоянии, может быть решена тремя принципиально разными способами:
1. Предсказание доменной организации за счёт поиска лучше охарактеризованных гомологов и аналогов;
2. Разработка мультиэпитопных синтетических белков на основе иммунодоминантных пептидов, идентифицированных в структуре белка с помощью пептидного эпитопного картирования;
3. Скрининговый подход, основанный на конструировании случайных двусторонних банков делеционных производных генов вирусных антигенов с отбором из него делеционных производных, обладающих способностью к хорошей экспрессии в клетках бактерий.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость, подкрепленная технической возможностью, в создании экономически эффективной и безопасной для человека альтернативы данным укоренившемся на практике подходам к разработке вакцин против сибиреязвенной инфекции. Необходимо отметить, что разработанные технологии получения псевдовирусных частиц, несущих заданную антигенную нагрузку, может быть в дальнейшем легко адаптирована и для создания иммунобиологических препаратов против иных инфекций, включая и многие вирусные заболевания.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
В настоящее время существует необходимость в создании вакцины против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать пожизненный иммунитет привитых животных. Вакцина, адаптированная для использования в отдаленных и труднодоступных районах РФ, в частности, на Крайнем Севере, должна обладать повышенным сроком хранения без утраты иммуногенной активности.
Помимо этого, для снижения себестоимости производства, предотвращения риска заражения людей и животных производственными штаммами желательно использовать полностью безопасные микроорганизмы, трансформация которых генетическими конструкциями, несущими гены ключевых антигенов B. anthracis, позволит получить высокоэффективную субъединичную рекомбинантную вакцину против сибирской язвы сельскохозяйственным животным.
Планируемые к разработке в рамках проекта способы получения комплексных препаратов, в частности, разработанная технологическая документация (лабораторный регламент) на изготовление экспериментального образца комплексной вакцины, позволят перейти к стадии доклинических испытаний разработки.
Основным типом потребителя разработки представляются крупные и средние биофабрики, обладающие опытом производства и испытания вакцин против особо опасных инфекций и дистрибьютерской сетью. Примерами таких предприятий могут служить ФКП «Щелковский биокомбинат» и ФГУП «Орловская биофабрика». Помимо этого, производство вакцины может быть организовано на мощностях небольших компаний биотехнологического профиля, обладающих мощностями про производству сухой стерильной биомассы и имеющих сертификаты и лицензии на производство парентеральных лечебных препаратов ветеринарного назначения.

В случае удачного решения поставленной задачи по снижению себестоимости дозы вакцины в 5-7 раз по сравнению с существующими аналогами и снижению розничной цены дозы в 3 раза объём выпуска продукции по новой технологии может оказаться сопоставим с объёмом потребления наиболее массовых ветеринарных вакцин, то есть, достигнуть 40 млн. доз в год при общей стоимости 4-6 млрд. руб.

Текущие результаты проекта:
1) Сконструирован искусственный ген протективного антигена B. anthracis, адаптированный по кодоновому составу для экспрессии в E. coli. С помощью искусственного гена PAG получена экспрессионная конструкция на оcнове вектора pQE30.
2) Разработан дизайн экспрессионной конструкции, кодирующей слитой продукт «pg10 DT57 1/2 - PAG» (с использованием протективного декорирующего белка головки бактериофага pg10 DT57 1/2и протективного антигена B. anthracis).
3) Проведен скрининг коллекции бактериофагов (16 изолятов). Отобраны патентно-чистые бактериофаги, пригодные для дисплея антигена на поверхностных белках вириона и/или содержащих гены полимеризующихся белков, пригодных в качестве скаффолда для дисплея антигенов.
4) Установлено, что отобранные патентно-чистые бактериофаги SKP004 и SKP009 порядка Caudovirales, синтезирующие слитой протективный антиген B. anthracis, инфекционны в отношении E.coli; строго вирулентны, нарабатываются в титре не менее 1010 БОЕ/мл и содержат гены декорирующих белков капсида, несущих вариабельные Ig-подобные домены.
5) Получены две экспрессионные конструкции pTTPx (белок трубки хвоста Т5-подобного бактериофага DT5C) и pTrP (белок, терминирующий хвост, Т5-подобного бактериофага DT5C) на базе вектора pET28a (Novagen), обеспечивающие продукцию в клетках E.coli белков бактериофагов, потенциально пригодных для дисплея антигенов на вирусоподобных частицах.
6) Получена экспрессионная конструкция, обеспечивающая продукцию полимеризующегося белка бактериофага порядка Caudovirales, слитого с целевым антигеном PAG20.
7) Показано, что полученная экспрессионная конструкция обеспечивает продукцию протективного антигена B. anthracis в водорастворимой форме.
8) Путем скрининга 20 единиц хранения ВКПМ проведен подбор (селекция) штамма E.coli для обеспечения максимального уровня продукции вирусоподобных частиц. Наилучшие показатели по сравнению с другими штаммами дал штамм TG1.
9) Показано, что полученные экспрессионные конструкции, кодирующие ген протективного антигена B. anthracis и слитой продукт «pg10 DT57 1/2 - PAG», обеспечивают уровень накопления целевых продуктов не менее 20% от общей массы клеточного белка штамма-продуцента. Доля растворимого белка в биомассе рекомбинантных штаммов составила 50% от общего количества целевого продукта.
10) Отработаны условия культивирования рекомбинантных продуцентов на основе E. coli, обеспечивающие максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме – свыше 5%.
11) Соисполнителем ПНИЭР ФГБНУ ВНИИФБиП во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН депонирован рекомбинантный штамм E. сoli, обеспечивающий максимальный уровень продукции слитого протективного антигена B. anthracis в нативной форме.
12) Разработана методика количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена B. anthracis в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli.
13) Разработана методика количественной оценки уровня накопления вирусоподобных частиц.