Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка диагностической панели, основанной на геномных технология нового поколения, для ранней и доклинической диагностики и профилактики социально значимых дегенеративных заболеваний мозга

Номер контракта: 14.607.21.0094

Руководитель: Иллариошкин Сергей Николаевич

Должность: Заместитель директора ФГБНУ НЦН по научной работе

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
нейродегенеративные заболевания, клиническая неврология, медицинская генетика, болезнь паркинсона, персонализированная медицина, доклиническая диагностика, тест-системы для молекулярно-генетического анализа, секвенирование нового поколения, экзомное секвенирование, диагностическая панель, биоинформатика, метод прямого секвенирования, метод мультиплексной пробо-зависимой лигазной реакции с амплификацией.

Цель проекта:
Диагностика и профилактика дегенеративных заболеваний мозга представляют собой чрезвычайно актуальную проблему современной неврологии в связи с их неоспоримой социальной значимостью, высоким удельным весом в общей структуре неврологической патологии, неуклонно прогрессирующим течением, тяжестью клинических проявлений, выраженной физической, психической и социальной дезадаптацией пациентов. Генетическая структура нейродегенеративных заболеваний в российской популяции до настоящего времени комплексно не определена. Особенностью этой группы заболеваний является высокая генетическая гетерогенность с фенотипической вариабельностью при одном и том же генетическом дефекте, что не позволяет однозначно связать фенотип и генотип и создает определенные трудности в выборе тактики лечения. Для многих нейродегенеративных заболеваний характерна длительная доклиническая стадия, на которой возможно проведение профилактических мероприятий, предотвращающих их развитие. Диагностика предрасположенности к развитию того или иного дегенеративного заболевания мозга является первостепенной задачей нейрогенетики в ближайшее время, и применение современных молекулярно-генетических подходов и геномных технологий нового поколения позволят быстро и с меньшими экономическими затратами диагностировать генетический дефект у данного больного.

Основные планируемые результаты проекта:
Планируется: 1) исследовать наиболее полный спектр мутаций в генах, ассоциированных с болезнью Паркинсона – SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, GBA, АТР13А2 методом мультиплексной пробо-зависимой лигазной реакции с амплификацией (MLPA); 2) впервые у российских пациентов с синдромами атипичного паркинсонизм и лобно-височными дегенерациями (деменциями) оценить встречаемость мутаций и полиморфизмов в генах MAPT, GRN, SNCA, GBA, FMR1, ATXN2, ATXN3, NCP1 и C9orf72 с привлечением методов ПЦР в реальном времени, прямого секвенирования и фрагментного анализа; 3) провести в российской популяции анализ генетических ассоциаций эссенциального тремора с полиморфизмами в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, выявленных в качестве кандидатов в предшествующих полногеномных исследованиях; 4) определить и уточнить клинико-генетические характеристики перечисленных дегенеративных заболеваний мозга с последующей разработкой диагностических алгоритмов; 5) разработать диагностическую панель, основанную на секвенировании нового поколения, для нейродегенеративных заболеваний с учетом генетической структуры в российской популяции и с включением в нее других ранее исследованных нейродегенераций (атаксий, заболеваний мотонейрона, параплегий, и др.); 6) оценить диагностические возможности разработанной панели на отдельных семьях с нейродегенеративной патологией с целью идентификации известных и, возможно, ранее не описанных мутаций; 7) исследование возможностей разработанной панели для диагностики ранних и доклинических стадий у родственников больных с найденными мутациями.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения проекта созданы и апробированы основанные на современных молекулярно-генетических методах диагностики наборы реагентов для выявления мутаций и полиморфизмов в генах MAPT, GRN, FMR1, NPС1, C9orf72, LINGO1, LINGO2, SLC1A2, которые позволяют исследовать наиболее полный спектр мутаций и полиморфизмов в генах, ассоциированных с основными нейродегенеративными заболеваниями такими как болезнь Паркинсона (БП), атипичный паркинсонизм и эссенциальный тремор у российских пациентов. Будет разработана диагностическая панель основанная на секвенировании нового поколения для диагностики наиболее социально значимых нейродегенеративных заболеваний мозга. Оценка диагностической значимости и возможностей этих разработанных диагностических продуктов позволит определить наиболее рациональный с медицинской и экономической точки зрения алгоритм диагностики наиболее социально значимых нейродегенеративных заболеваний мозга.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Применение разрабатываемого алгоритма диагностики базирующегося на современных молекулярно-генетических технологиях таких как различные модификации ПЦР (Reverse Primer-PCR; Real Time PCR ; multiplex ligation-dependent probe amplification), прямое секвенирование, фрагментный анализ и секвенирование следующего поколения (NGS) позволит достоверно и в кратчайшие сроки идентифицировать генетическую основу заболевания, что в свою очередь поможет врачу своевременно установить диагноз заболевания и выбрать правильную тактику лечения. Полученные результаты позволят диагностировать не только клинические стадии заболеваний, но и доклинические, что особенно важно для формирования достоверной группы «высокого риска» и возможностью проведения таким людям превентивной терапии.

Текущие результаты проекта:
За истекший период были разработаны наборы реагентов для выявления мутаций и полиморфизмов в генах MAPT, GRN, FMR1, NPС1, C9orf72, LINGO1, LINGO2, SLC1A2 и диагностическая панель основанная на секвенировании нового поколения с привлечением соответствующих биоинформативных подходов, лабораторные регламенты по изготовлению наборов реагентов и диагностической панели а также проведена апробация этих диагностических продуктов и разработанных нами ранее на репрезентативных выборках пациентов с соответствующими нозологиями (болезнь Паркинсона, синдром атипичного паркинсонизма, эссенциальный тремор и лобно-височные дегенерации (деменции)):
1. Применение нового метода - мультиплексной пробо-зависимой лигазной реакции с амплификацией (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) позволил нам одномоментно проводить скрининг мутаций сразу в нескольких основных генов, ассоциированных с БП: SNCA, PRKN, PINK1, PARK7, LRRK2 и ATP13A2. Особенностью этого метода является возможность детекции как точковых мутаций, так и изменения копийности экзонов генов (такие мутации, иногда захватывающие область сразу нескольких экзонов, трудно диагностируются обычными методами). В результате при исследовании 183 образцов ДНК пациентов с БП у 14 больных (7,7%) нами было выявлено носительство мутаций в генах PRKN, PINK1 и LRRK2, что составило высокий процент выявляемости мутаций при БП. Таким образом, учитывая мультиплексность, относительно невысокую стоимость и быстроту получения результата, метод MLPA можно применять как первоначальный скрининговый тест при дальнейшей разработки алгоритма диагностики БП.
2. Секвенирование всей кодирующей области гена GBA (по результатам многочисленных работ последних лет частота встречаемости мутаций в гене GBA при БП одна из самых высоких) для 218 пациентов с БП выявило 42 случая носительства мутаций, среди которых 4 мутации были выявлены нами впервые. Суммарная частота встречаемости мутаций в гене GBA в российской популяции больных с БП составила 19,2%, что подтверждает высокую значимость этого гена как фактора риска развития БП. В основном найденные мутации располагались в 8-11 экзонах. Подобранные нами праймеры позволили нарабатывать ампликоны для дальнейшего секвенирования в результате постановки одной ПЦР с последующим секвенированием с двух праймеров, что существенно упрощает детекцию мажорных мутаций в этом гене. Учитывая выявленную высокую частоту встречаемости мутаций в гене GBA при БП, по-видимому следует при разработке алгоритма диагностики БП рекомендовать проводить поиск мутаций в 8-11 экзонах гена GBA среди первоначальных скрининговых тестов.
3. При проведении полного секвенирования гена NPC1 (24 экзона) для 3 пациентов с клинической картиной болезни Ниманна-Пика типа С были обнаружены: в одном случае - две компаунд-гетерозиготные мутации — c.2861C>T (p.S954L), описанная ранее, и новая мутация c.326dupT, в другом случае - известная гомозиготная мутация c.3019C>G (p.P1007A) и в третьем случае – две компаунд-гетерозиготные мутации с.2861C>Т (p.S954L) и c.1625_1626insTG. В виду того что болезнь Ниманна-Пика типа С относится к редким заболеваниям и патагенные мутации равновероятно встречаются во всех 24 экзонах, целесобразно для пациентов с таким диагнозом проводить ДНК-диагностику с использованием разрабатываемой нами панели, а при выявлении мутаций в гене NPC1 проводить обязательное подтверждение с помощью разработанного нами, специализированного «набора реагентов для для выявления мутаций и полиморфизмов в гене NPС1»
4. Большинство нейродегенеративных заболеваний обусловленны «динамическими» мутациями - экспансиями микросателлитных повторов, которые могут быть как причиной моногенных форм заболеваний так и выступать в качестве факторов риска при многофакторных заболеваниях. В виду того что точное количество нуклеотидных повторов с помощью NGS-технологий определить невозможно, для фенотипов, обусловленных «динамическими» мутациями, приоритетной является ДНК-диагностика на основе фрагментного анализа. С помощью разработанных нами наборов реагентов был проведен мутационный скрининг для следующих генов:
- проведенная нами оценка ассоциации полиморфной микросателитной области гена SNCA - Rep1 (ген SNCA, кодирующий альфа-синуклеин, является одним из основных генов, нарушения в котором приводят к развитию БП, а также к другим нейродегеративным синуклеинопатиям) с развитием БП выявила достоверную, более частую встречаемость аллеля 263 у пациентов с БП по сравнению с контролем (7.2 и 4.5% соответственно; OR = 1.7; 95% CI = 1.11–2.48);
- по результатам нашего обследования в выборке пациентов с БП частота носительства промежуточной экспансии (число CGG-повторов варьировало от 39 до 43) в гене FMR1 составила 16.1% (11/68) а в контрольной группе – 3.2% (3/95), относительный риск - 5.9 с 95% доверительным интервалом 1.44 - 28.05 (р - 0.004);
- проведенный мутационный скрининг гена ATXN2 выявил носительство «промежуточного» аллеля в гетерозиготном состоянии для пациентов с БП (4,04%; р=0.046, OR 2.93, 95%, CI 1.01-9.12) и для пациентов с БАС (5,5%; р=0,026, OR 3,37, 95% CI 1,13–10.39);
анализ количества гексануклеотидных повторов в гене C9orf72 в группе пациентов с БАС выявил 7 пациентов с патологической экспансией (больше 50), частота встречаемости составила 3% (р<0,05). В группе БП носительства патологической экспансии выявлено не было, однако у 4 пациентов обнаружена «промежуточная» степень экспансии гексануклеотидных повторов (19–20 копий), частота которой при БП составила 2,3% (в контроле «промежуточной» экспансии не выявлено, p<0,05).
По результатам исследований:
- опубликованы 2 статьи в научных журналах: 1) Abramycheva NY et al. C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion in ALS patients from the Central European Russia population. Neurobiol Aging.2015;36(10):2908.e5-9; 2) Lysogorskaia EV et al. Genetic studies of Russian patients with amyotrophic lateral sclerosis.  Amyotroph Lat Scl Fr.2015; Nov 9:1-7;
- представленны 5 тезисов и 2 доклада на VII съезде Российского Общества Медицинских Генетиков и 1 тезис и 1 доклад на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной неврологии и психиатрии»
- готовится патентная заявка: «Способ и набор реагентов для выявления полиморфизмов в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2, определяющих генетическую ассоциацию с эссенциальным тремором.
Разработка диагностической панели основанной на секвенировании нового поколения проводится на базе ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИ СБ (RFMEFI62114X0003)