Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение и иммунохимическое исследование рекомбинантных антител-кандидатов для комплексной профилактики и терапии заболеваний, вызванных вирусом Эбола

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
вирус эбола, геморрагическая лихорадка, филовирусы, гликопротеин капсида, vp40, нейтрализующие антитела, пассивная иммунизация, рекомбинантные антитела

Цель проекта:
1. Проект направлен на решение проблемы получения рекомбинантных антител для пассивной иммунотерапии геморрагической лихорадки Эбола. 2. Цель проекта - получение, исследование и отбор моноклональных антител против вирусного гликопротеина для создания на их основе рекомбинантных антител как потенциальных компонентов нового комбинированного терапевтического средства борьбы с лихорадкой Эбола.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Планируется получение следующих основных результатов:
- в результате иммунизации будет получен и охарактеризован в терминах аффинности и кросс-реактивности представительный набор моноклональных антител против компонентов вирусного капсида;
- будут отобраны не менее трех моноклональных антител, специфичных к неперекрывающимся эпитопам вирусного гликопротеина;
- будет проведено выделение генов вариабельных доменов кандидатных моноклональных антител анти- Эбола, конструирование генов рекомбинантных антител анти-Эбола и системы их экспрессии;
- будут получены клеточные линии СНО - продуценты рекомбинантных антител анти-Эбола;
- будут осуществлены биосинтез, выделение и очистка экспериментальных образцов рекомбинантных антител анти-Эбола;
- на завершающей стадии проекта будет осуществлена иммунохимическая характеризация рекомбинантных антител анти-Эбола.
2. Кандидатные моноклональные антитела анти-Эбола должны обладать аффинностью, выраженной значением константы диссоциации комплекса антиген-антитело не более 5 нМ. Первичная структура вариабельных доменов кандидатных моноклональных антител анти-Эбола должна быть подтверждена методами генетического анализа и масс-спектрометрии. Степень очистки экспериментальных образцов рекомбинантных антител анти-Эбола должна быть не менее 95% по данным гель-электрофоретического и хроматографического анализов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом являются не менее трех экспериментальных образцов полноразмерных химерных антител анти-Эбола, охарактеризованных в терминах аффинности и кросс-реактивности в отношении белков вируса Эбола. Экспериментальные образцы рекомбинантных антител должны соответствовать аналитическим критериям для проведения в дальнейшем биологических испытаний на животных.
2. Для получения высокоаффинных моноклональных антител проводилась иммунизация мышей конъюгатом рекомбинантного гликопротеина вируса Эбола с белком теплового шока. Для оценки эпитопной специфичности моноклональных антител был применен комплексный подход, основанный на сравнительном анализе различных методов ИФА, иммуноблоттинга и исследования влияния гликозилирования. При получении клеточных линий СНО - продуцентов рекомбинантных антител будет использован уникальный би-промоторный экспрессионный вектор, отбор клонов-продуцентов будет осуществлен с помощью роботизированной флуоресцентной системы клеточного сортинга.
3. Учеными из США и Канады создана композиция терапевтических антител Zmapp для профилактики и лечения геморрагической лихорадки Эбола. Антитела нарабатываются в листьях табака. Набор рекомбинантных антител, разрабатываемый в ходе реализации настоящего проекта, может оказаться альтернативной использования композиции Zmapp или даже превосходить последний по своим биологическим свойствам.
4. Успешный отбор трех высокоаффинных моноклональных антител анти-Эбола позволяет с высокой степенью вероятности о достижении всех заявленных результатов.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Эпидемия геморрагической лихорадки Эбола представляет серъезную угрозу всему мировому сообществу. Поэтому достижение целей проекта помимо коммерческой составляющей представляет несомненный гуманитарный вклад в объединение усилий разных стран по борьбе с данной угрозой. Возникновение эпидемии в 2014 г. свидетельствует о том, что эпидемии геморрагической лихорадки Эбола могут иметь в дальнейшем рецидивирующий характер. В связи с данным обстоятельством представляется жизненно необходимым формирование наряду со средствами вакцинации национального резерва терапевтических средств для борьбы с последствиями заражения вирусом Эбола, а также индустриальных возможностей, позволяющих в короткие сроки увеличить производство инъекционных форм рекомбинантных терапевтических средств на основе моноклональных антител.

Возможным потребителем результатов ПНИЭР и созданного на их основе фармацевтического препарата являются организации Министерства здравоохранения, а также Министерства чрезвычайных ситуаций РФ.

На завершающей стадии проекта (2016 г.) будут проведены работы, целью которых является разработка технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера – ФГУП НПО «Микроген» Минздрава РФ. Также будут разработаны рекомендации по проведению биологических испытаний рекомбинантных антител анти-Эбола. В 2017 г. планируется проведение работ по масштабированию процесса биосинтеза рекомбинантных антител анти-Эбола. Будут начаты биологические испытания и доклинические исследования.


Текущие результаты проекта:
Проведена иммунизация мышей линии Balb/c иммуноконъюгатом рекомбинантного белка G вируса Эбола с белком теплового шока HSP65. В результате проведения селекции, скрининга и клонирования новых мышиных гибридом были отобраны 5 гибридом, проведено изотипирование культуральных супернатантов. Для проведения детального иммунохимического анализа и отбора антител-кандидатов были отобраны 3 гибридомы, продуцирующие антитела IgM изотипа, и 2 – IgG изотипа. Осуществлены выделение и очистка всех антител из асцитной жидкости методами аффинной хроматографии на белок G- сефарозе (антитела GPE118 и GPE534 IgG-изотипа) и преципитации эуглобулинов (антитела GPE274, GPE325 и GPE463 IgM-изотипа).

Для отбора не менее 3 кандидатных моноклональных антител (МоАт) анти-Эбола исследовано связывание полученных антител с рекомбинантным белком G вируса Эбола в растворе и при его иммобилизации. Для подтверждения специфичности новой панели МоАт также использовали метод иммуноблота, по данным которого все МоАт из новой панели анти-Эбола интенсивно взаимодействуют с полноразмерным белком G. При этом ряд антител взаимодействуют с минорными фрагментами гликопротеина, что подтверждает направленность МоАт к разным эпитопам. Проведено эпитопное картирование новой панели антител анти-Эбола. В результате картирования эпитопов новой панели МоАт анти-Эбола методом сэндвич-ИФА установлены 3 МоАт, которые и являются кандидатными моноклональными антителами для проведения дальнейших исследований. Все кандидатные МоАт анти-Эбола обладают аффинностью, выраженной значением константы диссоциации комплекса антиген-антитело не более 5 нМ, что удовлетворяет требованию ТЗ.

Из суммарной РНК клеток гибридом методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции проведено выделение и клонирование кДНК вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей кандидатных МоАт, установлена их нуклеотидная последовательность. Методом масс-спектрометрии установлено соответствие аминокислотной последовательности вариабельных доменов последовательностям пептидов, полученных в результате трипсинолиза нативных антител.