Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка тест-системы неинвазивной диагностики для планирования терапии рака легкого на основе высокопроизводительного секвенирования циркулирующей опухолевой ДНК.

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
тест-система, немелкоклеточный рак легкого, таргетная терапия, ингибиторы тирозинкиназы, циркулирующая днк, биомаркеры чувствительности к терапии, приобретенная резистентность, мутации гена egfr, неинвазивная диагностика, высокопроизводительное секвенирование.

Цель проекта:
Получение значимых научных результатов и экспериментальных образцов тест-систем, позволяющих перейти к созданию новых видов диагностической продукции и предоставлению медицинским и научно-исследовательским организациям новых и эффективных средств неинвазивной онкодиагностики и молекулярно-генетического типирования опухолей.

Основные планируемые результаты проекта:
— Коллекция биологических образцов и база данных, обеспечивающая учет коллекции и анализ ассоциий между клиническими параметрами и биомаркерами;
— результаты патентных исследований по теме использования циркулирующей ДНК для онкодиагностики; панели биомаркеров чувствительности и резистентности к ингибиторам тирозин-киназы;
— экспериментальный образец набора для выделения циркулирующей ДНК из плазмы и фракции циркулирующей ДНК, сорбированной на поверхности клеток крови, для дальнейшего использования в составе тест-систем;
— панель биомаркеров чувствительности и приобретенной резистентности к терапии ингибиторами тирозин-киназы, как основа для разработки диагностических тест-систем для планирования таргетной терапии;
— алгоритм принятия решения о назначении терапии ингибиторами тирозин-киназы на основании анализа разработанных панелей биомаркеров;
— экспериментальные образцы тест-системы для неинвазивного (по анализу крови) определения чувствительности и приобретенной резистентности к таргетной терапии ингибиторами тирозин-киназы EGFR;
— программное обеспечение для анализа данных таргетного секвенирования и интерпретации результата.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Создание коллекции биологических образцов.
Проведение исследований в рамках проекта требует создания обширной коллекции биологических образцов опухолей и циркулирующей ДНК больных немелкоклеточнымраком легкого. В ходе работы будет сформирована коллекция (банк) биологических образцов, а именно:
- не менее 50 образцов опухолевой ткани и образцов циркулирующей ДНК больных раком легкого, до получения терапии ингибитором тирозин-киназы;
- не менее 50 образцов опухолевой ткани и циркулирующей ДНК больных раком легкого, полученных после клинического подтверждения приобретенной резистентности к терапии ингибитором тирозин-киназы;
- не менее 50 образцов циркулирующей ДНК больных раком легкого, получающих терапию ингибитором тирозин-киназы;
2. Разработка эффективной системы выделения циркулирующей ДНК для диагностических целей.
Для обеспечения наиболее широкого внедрения в клиническую практику разрабатываемая тест-система должна быть пригодна для анализа с самым широким спектром доступного биоматериала. Поэтому в рамках выполняемой ПНИ поставлена задача создания системы выделения опухолевой ДНК из таких биологических образцов как плазма крови, пунктаты асцитной жидкости, цитологические и гистологические препараты.
3. Разработка панели биомаркеров чувствительности и резистентности к ингибиторам тирозин-киназы в циркулирующей ДНК
Для решения задачи своевременного выявления и мониторинга приобретенной резистентности с помощью каталога соматических мутаций, найденных при раке легкого (COSMIC, http://www.sanger.ac.uk/cosmic/) будет проведен поиск всех соматических мутаций, ассоциированных с чувствительностью и резистентностью к терапии к TKI. С использование таких баз данных как Metacore будут реконструированы сигнальные пути, вовлеченные в механизмы ответа на терапию TKI. Обобщение таких мета-данных позволит создать панель биомаркеров и дизайн системы обогащения для таргетного секвенирования релевантных последовательностей циркулирующей ДНК.
4. Разработка тест-системы для неинвазивного определения чувствительности и резистентности к ингибиторам тирозин-киназы в циркулирующей ДНК
В ходе решения поставленной задачи будет разработана аналитическая тест-система для неинвазивного выявления чувствительности больных к лечению, а также для мониторинга и раннего выявления приобретенной резистентностик терапии ингибиторами тирозинкиназ.
Для оптимизации состава и диагностических характеристик тест-системы будет выполнена первичная верификация на образцах цирДНК не менее чем 50 пациентов до и после получения таргетных препаратов.
Для валидации разработанных образцов тест-системы будет проведено ретроспективное исследование на 50 пациентах с немелкоклеточным раком легкого, позволяющее объективно оценить диагностические характеристики: диагностическую точность, чувствительность и специфичность, положительную и отрицательную предиктивную значимость. Мощность выборки и другие параметры исследования, а также статистическая обработка результатов будет выполнена с помощью пакета программного обеспечения nQueryAdvisor и nTerim 7.0.
По результатам тестирования будут оптимизированы пороговые значения анализируемых биомаркеров и определены дальнейшие направления развития разработанных тест-систем.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основным объектом дальнейшего внедрения из числа результатов проекта является экспериментальный образец тест-системы, который найдет широкое применение в следующих областях:
1) диагностика пациентов с немелкоклеточным раком легкого для определения чувствительности к терапии препаратами ингибиторами тирозин-киназы рецептора эпидермального фактора роста.
С 2012 года в РФ компания AstraZeneca, производитель препарата Иресса (гефитиниб), проводит тестирование пациентов на чувствительность к терапии ингибиторами тирозинкиназ за собственные средства. Объем проведенных исследований за 2013 год составил более 40 млн. руб. и демонстрирует динамичный рост, а суммарный объем продаж препаратов Иресса и Тарцева (эрлотиниб) превысил 700 млн. руб.(по данным IMS Health).
В то же время, проведение тестирования ограничено низкой доступностью опухолевого материала – до 50% больных не могут быть протестированы по этой причине. Таким образом, появление неинвазивного теста существенно увеличит объем рынка таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназ. Кроме того, включение в состав теста расширенного набора сенситизирующих мутаций позволит выявлять дополнительные количества пациентов, чувствительных к терапии, что является важным конкурентным преимуществом по сравнению с доступными аналогами.
Следует отметить, что патентная защита на препараты гефитиниб и эрлотиниб истекает в 2016 году, после чего на рынке появятся дженерики и объем потребления в натуральном выражении значительно вырастет. Вместе с тем, увеличится и потребность в тестировании пациентов, а значит и коммерческий эффект разрабатываемой тест-системы.
При минимальной модификации, разрабатываемый набор сможет быть использован для диагностики чувствительных случаев других опухолей с активацией рецепторной киназы EGFR, и, таким образом, имеет значительный потенциал к расширению диагностической индикации.
2) мониторинг приобретенной резистентности к терапии препаратами эрлотиниб и гефитиниб.
Несмотря на все преимущества таргетной терапии, ее принципиальным ограничением является развитие приобретенной резистентности, которая неизбежно развивается у большинства пациентов. Важной задачей является выявление резистентности еще до проявления клинических признаков прогрессии опухоли (радиологических и др.). Решение этой проблемы с помощью разрабатываемой тест-системы позволит оптимизировать терапию и повысить эффективность лечения, в чем также заинтересованы производители препаратов ингибиторов тирозинкиназ, так как это позволит обосновать увеличение объема государственных закупок и перераспределить его на пациентов, отвечающих на терапию.
Следует отметить, что мониторинг приобретенной резистентности требует регулярного тестирования на протяжении всех курсов терапии, что обеспечивает большой потенциал коммерциализации для разрабатываемой тест-системы.
3) стратификация пациентов в рамках клинических испытаний и научные исследования.
Исследования в области применения ингибиторов тирозин-киназы для терапии солидных опухолей активно ведутся в большом числе исследовательских организаций и фармацевтических компаний. Около 10 ингибиторов тирозин-киназы EGFRнаходятся на разных фазах клинических испытаний, - соответствующие испытания в России потребуют использования так называемого сопутствующего биомаркера (companion biomarker) для демонстрации достаточной эффективности и выхода на рынок. Таким образом, результаты реализации проекта могут быть вовлечены в проведение клинических испытаний и сопровождать новые препараты на рынке.

Текущие результаты проекта:
1. Разработан состав биомаркерной панели для детекции чувствительности и резистентности ингибиторам тирозин-киназы в циркулирующей ДНК. На основе выбранных биомаркеров созданы два варианта дизайна панели для таргетного обогащения целевыми последовательностями на основе подходов ПЦР-амплификации и селективной гибридизации. При этом реализован уникальных алгоритм анализа, позволяющий учесть специфические паттерны фрагментации циркулирующей ДНК, что значительно повысит чувствительность конечного изделия.
2. Были разработаны методики выделения ДНК из плазмы крови, бронхо-альвеолярных смывов, пунктатов асцитной жидкости, биоптатов тканей легкого и цитологического материала. Разработанные методики обеспечивают выделение ДНК с выходом более 80% и сравнимы по эффективности выделения с наборами, представленными на рынке. В результате выполнения проекта были созданы экспериментальные образцы наборов для выделения циркулирующей ДНК.
3. Создана база данных, обеспечивающая не только учет коллекции биологических образцов, но и способность проводить последующий анализ ассоциаций между клиническими параметрами и биомаркерами. База данных содержит клиническую информацию о пациенте, и ее структура пригодна для автоматического анализа данных. Автоматический анализ ассоциаций между клиническими параметрами и биомаркерами может позволить проводить ретроспективные исследования и выявлять клинически значимые изменения в молекулярном профиле опухоли на основании проведенных ранее исследований.
4.Проведено таргетное секвенирование ДНК-библиотек, полученных из 26 образцов опухолевой ткани от пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого на приборе MiSeq (Illumina). Покрытие образцов было достаточным для определения низкочастотных мутаций (<5%). В результате анализа данных клинически значимые мутации обнаружены у 13 пациентов. В том числе, у 8 пациентов из 25 (32%) обнаружены активирующие мутации EGFR. Дополнительно к анализу мутационного профиля опухолевых тканей был проведен анализ с целью выявления факта амплификации генов. В процессе анализа была обнаружена амплификация гена EGFR у двух пациентов, являющаяся как прогностическим, так и предиктивным биомаркером.