Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro
Номер контракта: 14.607.21.0129
Руководитель: Лузгина Наталия Геннадьевна
Должность руководителя: Уполномоченное лицо
Докладчик: Наход Валерия Игоревна, Младший научный сотрудник
Ключевые слова:
испытания химической продукции, безопасность химической продукции для здоровья человека, тест-система, реконструкция кожи человека, классы опасности химической продукции.
Цель проекта:
1.Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro.
2.Разработать отечественную тест-систему на основе кератиноцитов человека для обеспечения практической реализации утвержденных в РФ методов испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro (ГОСТ 32634-2014), получения достоверной информации о возможном риске воздействия химической продукции на организм человека, сокращения количества лабораторных животных, используемых при испытаниях химической продукции, гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в части обращения, сертификации и оценки безопасности химической продукции.
Разработать (с учётом требований ГОСТ 32419-2013) новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи in vitro с использованием разработанной тест-системы.
Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных результатов:
- Банк биологических образцов и первичных культур (создается за счет внебюджетных средств);
- Регламент сбора, хранения и транспортировки биологических образцов;
- Банк кератиноцитов базовой клеточной культуры (базовых клеточных культур);
- Лабораторный регламент получения клеточного компонента разрабатываемой тест-системы - стандартизованной клеточной модели кожи человека;
- Экспериментальные образцы тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro в составе: планшет (заимствуется), клеточный компонент (разрабатывается), контрольное вещество (разрабатывается);
- Протоколы исследований экспериментальных образцов тест-системы при использовании в качестве объекта испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro в соответствии с ГОСТ 32634-2014;
- Проект методических рекомендаций по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы.
- Предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ(ЭР), вовлечению их в хозяйственный оборот.
- Проект технического задания на проведение ОКР на тему «Организация опытного производства тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro».
2. Основные характеристики планируемых результатов:
- Банк биологических образцов - эксплантов кожи, полученных от доноров прижизненно, будет сформирован с соблюдением законодательства РФ и нормативных документов о донорстве на основании разработанного Регламента сбора, хранения и транспортировки биологических образцов.
- С использованием клеток выбранной клеточной линии (клеточных линий) будет получена клеточная модель кожи человека, представляющая собой многослойный плоский ороговевающий эпителий.
- В рамках настоящего проекта будет разработан и экспериментально апробирован новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз) / раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы. Для этого будут проведены испытания ряда химических веществ, обладающих коррозивными/раздражающими кожу человека свойствами (не менее 3 веществ, относящихся к разным классам опасности), традиционными методами – с использованием лабораторных животных.
- Банк биологических образцов и первичных культур (создается за счет внебюджетных средств);
- Регламент сбора, хранения и транспортировки биологических образцов;
- Банк кератиноцитов базовой клеточной культуры (базовых клеточных культур);
- Лабораторный регламент получения клеточного компонента разрабатываемой тест-системы - стандартизованной клеточной модели кожи человека;
- Экспериментальные образцы тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro в составе: планшет (заимствуется), клеточный компонент (разрабатывается), контрольное вещество (разрабатывается);
- Протоколы исследований экспериментальных образцов тест-системы при использовании в качестве объекта испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro в соответствии с ГОСТ 32634-2014;
- Проект методических рекомендаций по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы.
- Предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ(ЭР), вовлечению их в хозяйственный оборот.
- Проект технического задания на проведение ОКР на тему «Организация опытного производства тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro».
2. Основные характеристики планируемых результатов:
- Банк биологических образцов - эксплантов кожи, полученных от доноров прижизненно, будет сформирован с соблюдением законодательства РФ и нормативных документов о донорстве на основании разработанного Регламента сбора, хранения и транспортировки биологических образцов.
- С использованием клеток выбранной клеточной линии (клеточных линий) будет получена клеточная модель кожи человека, представляющая собой многослойный плоский ороговевающий эпителий.
- В рамках настоящего проекта будет разработан и экспериментально апробирован новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз) / раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы. Для этого будут проведены испытания ряда химических веществ, обладающих коррозивными/раздражающими кожу человека свойствами (не менее 3 веществ, относящихся к разным классам опасности), традиционными методами – с использованием лабораторных животных.
Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
По данным ВОЗ объемы производства и использования химической продукции в мире постоянно возрастают, что не только приводит к увеличению уровня загрязнения окружающей среды, но и повышает опасность, связанную с вредным воздействием химической продукции на здоровье человека. Ежегодно в мире появляется примерно 1,5 тыс. новых видов химической продукции дополнительно к тем 80-90 тыс., которые производятся в настоящее время (63-я сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения).
Несмотря на то, что Российская Федерация (РФ) является одним из крупнейших мировых производителей и потребителей химической продукции, единые подходы к ее безопасному обращению до сих пор не разработаны, в связи с чем нормативное обеспечение безопасного обращения химической продукции в РФ приобретает особую актуальность.
Требования российского законодательства в этой области постоянно усложняются и модифицируются, в том числе, с целью их гармонизации с международными нормативными правовыми актами, регулирующими данную сферу деятельности. В настоящее время все используемые на территории РФ химические продукты должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований, требованиям безопасности и иметь подтверждение соответствия им. Процесс установления подобных требований регулируется главным образом ФЗ № 184 «О техническом регулировании», ФЗ № 52 «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и Соглашением Таможенного союза (ТС) РФ, Республики Беларусь и Республики Казахстан по санитарным мерам. В частности, разработан межгосударственный стандарт (ГОСТ) 32419-2013 «Классификация опасности химической продукции. Общие требования»; проект Федерального закона «Технический регламент «О безопасности химической продукции». Согласно этим документам, в отношении химической продукции в обязательном порядке должна быть оценена ее опасность для здоровья человека.
Разработаны методические подходы для качественной и количественной оценки этих рисков (Basketter D., 2012, PMID: 23118595; Kolle S., 2012, PMID: 22939940; Alépée N., 2014, PMID: 24211528), позволяющей классифицировать химическую продукцию по классам опасности. Практически в РФ с этой целью используются данные экспериментальных исследований, объектом которых являются лабораторные животные. Вместе с тем известно, что ответ различных организмов на токсическое воздействие характеризуется видовой специфичностью (Tralau T ., 2015, PMID: 25820917; van de Sandt J., 1995, PMID: 20650075). В этой связи в мире все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности химических соединений и их смесей в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеток человека. Так, Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) разработаны и внедрены в практику испытаний химической продукции валидированные in vitro тесты для оценки коррозирующего и раздражающего действия химических веществ и их смесей на кожу человека (OECD Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method и OECD Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method, соответственно) с использованием реконструированного эпителия человека (клеточная модель кожи) на основе нормальных кератиноцитов человека.
В Российской Федерации также утверждены подобные Методические рекомендации: ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro» (Дата введения в действие: 01.06.2015; дата последнего изменения: 16.07.2015). Однако их реальное внедрение в практику испытаний химической продукции сдерживается отсутствием на рынке РФ объекта для экспериментальных исследований – специализированных клеточных тест-систем. Как известно, к клеточным моделям органов и тканей, которые предназначенным для использования в качестве объектов испытаний, выдвигаются особые требования, обусловленные спецификой применения. Они должны быть стандартизованы в части структурно-функциональных характеристик клеток, входящих в их состав, валидированы в отношении ответа на контрольные вещества, а также должны обеспечивать получение воспроизводимых количественных результатов в части изучаемого процесса. Лишь единичные коммерческие клеточные модели удовлетворяют этим условиям (Alépée N., 2015, PMID: 26187475; Eskes C., 2011, PMID: 22085589; Desprez B., 2015, PMID: 26320836). В частности, биотехнологический продукт EpiSkinTM, представляющий собой стандартизованную смесь нормальных кератиноцитов человека, полученных от различных доноров и культивируемых на коллагеновом матриксе, а также продукты EpiDermTM (EPI-200), SkinEthicTM RHE и epiCS®. Именно эти коммерческие тест-системы на основе кератиноцитов человека рекомендовано использовать в качестве объекта испытаний химической продукции согласно методикам OECD. Однако вышеперечисленные тест-системы имеют короткий срок использования (до трех дней с момента их получения производителем), что делает проблематичным их доставку в РФ, а также высокую рыночную стоимость (до 500 евро за один 96-луночный планшет с готовыми клеточными моделями). Очевидно, что разработка валидированных моделей реконструированной кожи человека непосредственно исследователями, проводящими сертификационные испытания в соответствии с утвержденными методами (ГОСТ 32634-2014), проблематична в части обеспечения стандартизации исследований, что может привести к снижению достоверности результатов испытаний.
Таким образом, внедрение современных методик оценки безопасности химической продукции для здоровья человека в РФ in vitro определяет необходимость разработки отечественных тест-систем, пригодных для этих целей.
Несмотря на то, что Российская Федерация (РФ) является одним из крупнейших мировых производителей и потребителей химической продукции, единые подходы к ее безопасному обращению до сих пор не разработаны, в связи с чем нормативное обеспечение безопасного обращения химической продукции в РФ приобретает особую актуальность.
Требования российского законодательства в этой области постоянно усложняются и модифицируются, в том числе, с целью их гармонизации с международными нормативными правовыми актами, регулирующими данную сферу деятельности. В настоящее время все используемые на территории РФ химические продукты должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований, требованиям безопасности и иметь подтверждение соответствия им. Процесс установления подобных требований регулируется главным образом ФЗ № 184 «О техническом регулировании», ФЗ № 52 «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и Соглашением Таможенного союза (ТС) РФ, Республики Беларусь и Республики Казахстан по санитарным мерам. В частности, разработан межгосударственный стандарт (ГОСТ) 32419-2013 «Классификация опасности химической продукции. Общие требования»; проект Федерального закона «Технический регламент «О безопасности химической продукции». Согласно этим документам, в отношении химической продукции в обязательном порядке должна быть оценена ее опасность для здоровья человека.
Разработаны методические подходы для качественной и количественной оценки этих рисков (Basketter D., 2012, PMID: 23118595; Kolle S., 2012, PMID: 22939940; Alépée N., 2014, PMID: 24211528), позволяющей классифицировать химическую продукцию по классам опасности. Практически в РФ с этой целью используются данные экспериментальных исследований, объектом которых являются лабораторные животные. Вместе с тем известно, что ответ различных организмов на токсическое воздействие характеризуется видовой специфичностью (Tralau T ., 2015, PMID: 25820917; van de Sandt J., 1995, PMID: 20650075). В этой связи в мире все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности химических соединений и их смесей в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеток человека. Так, Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) разработаны и внедрены в практику испытаний химической продукции валидированные in vitro тесты для оценки коррозирующего и раздражающего действия химических веществ и их смесей на кожу человека (OECD Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method и OECD Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method, соответственно) с использованием реконструированного эпителия человека (клеточная модель кожи) на основе нормальных кератиноцитов человека.
В Российской Федерации также утверждены подобные Методические рекомендации: ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro» (Дата введения в действие: 01.06.2015; дата последнего изменения: 16.07.2015). Однако их реальное внедрение в практику испытаний химической продукции сдерживается отсутствием на рынке РФ объекта для экспериментальных исследований – специализированных клеточных тест-систем. Как известно, к клеточным моделям органов и тканей, которые предназначенным для использования в качестве объектов испытаний, выдвигаются особые требования, обусловленные спецификой применения. Они должны быть стандартизованы в части структурно-функциональных характеристик клеток, входящих в их состав, валидированы в отношении ответа на контрольные вещества, а также должны обеспечивать получение воспроизводимых количественных результатов в части изучаемого процесса. Лишь единичные коммерческие клеточные модели удовлетворяют этим условиям (Alépée N., 2015, PMID: 26187475; Eskes C., 2011, PMID: 22085589; Desprez B., 2015, PMID: 26320836). В частности, биотехнологический продукт EpiSkinTM, представляющий собой стандартизованную смесь нормальных кератиноцитов человека, полученных от различных доноров и культивируемых на коллагеновом матриксе, а также продукты EpiDermTM (EPI-200), SkinEthicTM RHE и epiCS®. Именно эти коммерческие тест-системы на основе кератиноцитов человека рекомендовано использовать в качестве объекта испытаний химической продукции согласно методикам OECD. Однако вышеперечисленные тест-системы имеют короткий срок использования (до трех дней с момента их получения производителем), что делает проблематичным их доставку в РФ, а также высокую рыночную стоимость (до 500 евро за один 96-луночный планшет с готовыми клеточными моделями). Очевидно, что разработка валидированных моделей реконструированной кожи человека непосредственно исследователями, проводящими сертификационные испытания в соответствии с утвержденными методами (ГОСТ 32634-2014), проблематична в части обеспечения стандартизации исследований, что может привести к снижению достоверности результатов испытаний.
Таким образом, внедрение современных методик оценки безопасности химической продукции для здоровья человека в РФ in vitro определяет необходимость разработки отечественных тест-систем, пригодных для этих целей.
Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основная область применения ожидаемых результатов – сертификационные испытания безопасности химической продукции в отношении здоровья человека. Разрабатываемая тест-система предназначена для использования в качестве объекта испытаний при проведении исследований в соответствии с ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro».
Другие возможные сферы применения разрабатываемой тест-системы:
1) сертификационные испытания безопасности косметической продукции;
2) доклинические исследования безопасности лекарственных средств, предназначенных для наружного применения;
3) экологический мониторинг;
4) санитарно-гигиеническое нормирование и обоснование безопасных уровней содержания химических веществ и их смесей;
5) технолого-биологический контроль качества природоохранных мероприятий и процессов очистки выбросов в окружающую среду.
Возможность и условия применения разрабатываемой тест-системы по данным направлениям должна быть уточнена в результате проведения тематических ПНИ(ЭР).
Внедрение в практику сертификационных испытаний химической продукции разрабатываемых методических рекомендации по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы, повысит информативность сертификационных испытаний (за счет получения возможности оценивать видоспецифические для человека риски воздействия химической продукции на организм), сократит их продолжительность, снизит себестоимость, позволит уменьшить количество лабораторных животных, используемых в тестах in vivo, что будет способствовать гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в области безопасного обращения химической продукции. После завершения проекта Консорциум Исполнителей планирует инициировать процедуру экспертной оценки информативности разработанных методических рекомендаций с целью решения вопроса о придании ей статуса нормативной национальной методики.
Другие возможные сферы применения разрабатываемой тест-системы:
1) сертификационные испытания безопасности косметической продукции;
2) доклинические исследования безопасности лекарственных средств, предназначенных для наружного применения;
3) экологический мониторинг;
4) санитарно-гигиеническое нормирование и обоснование безопасных уровней содержания химических веществ и их смесей;
5) технолого-биологический контроль качества природоохранных мероприятий и процессов очистки выбросов в окружающую среду.
Возможность и условия применения разрабатываемой тест-системы по данным направлениям должна быть уточнена в результате проведения тематических ПНИ(ЭР).
Внедрение в практику сертификационных испытаний химической продукции разрабатываемых методических рекомендации по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы, повысит информативность сертификационных испытаний (за счет получения возможности оценивать видоспецифические для человека риски воздействия химической продукции на организм), сократит их продолжительность, снизит себестоимость, позволит уменьшить количество лабораторных животных, используемых в тестах in vivo, что будет способствовать гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в области безопасного обращения химической продукции. После завершения проекта Консорциум Исполнителей планирует инициировать процедуру экспертной оценки информативности разработанных методических рекомендаций с целью решения вопроса о придании ей статуса нормативной национальной методики.
Текущие результаты проекта:
1. Выполнен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках НИР.
2. Проведены патентные исследования.
3. Разработан протокол получения клеточного компонента тест-системы (ККТС) на основе иммортализованных клеток.
4. Наработаны экспериментальные образцы ККТС на основе иммортализованных клеток для экспериментальных испытаний.
5. Экспериментально обоснован выбор контрольных веществ тест-системы (КВ) с использованием ККТС на основе иммортализованных клеток.
6. Проведены испытания экспериментальных образцов на соответствие требованиям ТЗ.
7. Обоснован выбор тестируемых веществ.
2. Проведены патентные исследования.
3. Разработан протокол получения клеточного компонента тест-системы (ККТС) на основе иммортализованных клеток.
4. Наработаны экспериментальные образцы ККТС на основе иммортализованных клеток для экспериментальных испытаний.
5. Экспериментально обоснован выбор контрольных веществ тест-системы (КВ) с использованием ККТС на основе иммортализованных клеток.
6. Проведены испытания экспериментальных образцов на соответствие требованиям ТЗ.
7. Обоснован выбор тестируемых веществ.