Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro

испытания химической продукции, безопасность химической продукции для здоровья человека, тест-система, реконструкция кожи человека, классы опасности химической продукции.

1.Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro. 2.Разработать отечественную тест-систему на основе кератиноцитов человека для обеспечения практической реализации утвержденных в РФ методов испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro (ГОСТ 32634-2014), получения достоверной информации о возможном риске воздействия химической продукции на организм человека, сокращения количества лабораторных животных, используемых при испытаниях химической продукции, гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в части обращения, сертификации и оценки безопасности химической продукции. Разработать (с учётом требований ГОСТ 32419-2013) новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи in vitro с использованием разработанной тест-системы.

1. Краткое описание основных результатов:
- Банк биологических образцов и первичных культур (создается за счет внебюджетных средств);
- Регламент сбора, хранения и транспортировки биологических образцов;
- Банк кератиноцитов базовой клеточной культуры (базовых клеточных культур);
- Лабораторный регламент получения клеточного компонента разрабатываемой тест-системы - стандартизованной клеточной модели кожи человека;
- Экспериментальные образцы тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro в составе: планшет (заимствуется), клеточный компонент (разрабатывается), контрольное вещество (разрабатывается);
- Протоколы исследований экспериментальных образцов тест-системы при использовании в качестве объекта испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro в соответствии с ГОСТ 32634-2014;
- Проект методических рекомендаций по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы.
- Предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ(ЭР), вовлечению их в хозяйственный оборот.
- Проект технического задания на проведение ОКР на тему «Организация опытного производства тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro».

2. Основные характеристики планируемых результатов:
- Банк биологических образцов - эксплантов кожи, полученных от доноров прижизненно, будет сформирован с соблюдением законодательства РФ и нормативных документов о донорстве на основании разработанного Регламента сбора, хранения и транспортировки биологических образцов.
- С использованием клеток выбранной клеточной линии (клеточных линий) будет получена клеточная модель кожи человека, представляющая собой многослойный плоский ороговевающий эпителий.
- В рамках настоящего проекта будет разработан и экспериментально апробирован новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз) / раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы. Для этого будут проведены испытания ряда химических веществ, обладающих коррозивными/раздражающими кожу человека свойствами (не менее 3 веществ, относящихся к разным классам опасности), традиционными методами – с использованием лабораторных животных.

По данным ВОЗ объемы производства и использования химической продукции в мире постоянно возрастают, что не только приводит к увеличению уровня загрязнения окружающей среды, но и повышает опасность, связанную с вредным воздействием химической продукции на здоровье человека. Ежегодно в мире появляется примерно 1,5 тыс. новых видов химической продукции дополнительно к тем 80-90 тыс., которые производятся в настоящее время (63-я сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения).
Несмотря на то, что Российская Федерация (РФ) является одним из крупнейших мировых производителей и потребителей химической продукции, единые подходы к ее безопасному обращению до сих пор не разработаны, в связи с чем нормативное обеспечение безопасного обращения химической продукции в РФ приобретает особую актуальность.
Требования российского законодательства в этой области постоянно усложняются и модифицируются, в том числе, с целью их гармонизации с международными нормативными правовыми актами, регулирующими данную сферу деятельности. В настоящее время все используемые на территории РФ химические продукты должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований, требованиям безопасности и иметь подтверждение соответствия им. Процесс установления подобных требований регулируется главным образом ФЗ № 184 «О техническом регулировании», ФЗ № 52 «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и Соглашением Таможенного союза (ТС) РФ, Республики Беларусь и Республики Казахстан по санитарным мерам. В частности, разработан межгосударственный стандарт (ГОСТ) 32419-2013 «Классификация опасности химической продукции. Общие требования»; проект Федерального закона «Технический регламент «О безопасности химической продукции». Согласно этим документам, в отношении химической продукции в обязательном порядке должна быть оценена ее опасность для здоровья человека.
Разработаны методические подходы для качественной и количественной оценки этих рисков (Basketter D., 2012, PMID: 23118595; Kolle S., 2012, PMID: 22939940; Alépée N., 2014, PMID: 24211528), позволяющей классифицировать химическую продукцию по классам опасности. Практически в РФ с этой целью используются данные экспериментальных исследований, объектом которых являются лабораторные животные. Вместе с тем известно, что ответ различных организмов на токсическое воздействие характеризуется видовой специфичностью (Tralau T ., 2015, PMID: 25820917; van de Sandt J., 1995, PMID: 20650075). В этой связи в мире все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности химических соединений и их смесей в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеток человека. Так, Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) разработаны и внедрены в практику испытаний химической продукции валидированные in vitro тесты для оценки коррозирующего и раздражающего действия химических веществ и их смесей на кожу человека (OECD Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method и OECD Test No. 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method, соответственно) с использованием реконструированного эпителия человека (клеточная модель кожи) на основе нормальных кератиноцитов человека.
В Российской Федерации также утверждены подобные Методические рекомендации: ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro» (Дата введения в действие: 01.06.2015; дата последнего изменения: 16.07.2015). Однако их реальное внедрение в практику испытаний химической продукции сдерживается отсутствием на рынке РФ объекта для экспериментальных исследований – специализированных клеточных тест-систем. Как известно, к клеточным моделям органов и тканей, которые предназначенным для использования в качестве объектов испытаний, выдвигаются особые требования, обусловленные спецификой применения. Они должны быть стандартизованы в части структурно-функциональных характеристик клеток, входящих в их состав, валидированы в отношении ответа на контрольные вещества, а также должны обеспечивать получение воспроизводимых количественных результатов в части изучаемого процесса. Лишь единичные коммерческие клеточные модели удовлетворяют этим условиям (Alépée N., 2015, PMID: 26187475; Eskes C., 2011, PMID: 22085589; Desprez B., 2015, PMID: 26320836). В частности, биотехнологический продукт EpiSkinTM, представляющий собой стандартизованную смесь нормальных кератиноцитов человека, полученных от различных доноров и культивируемых на коллагеновом матриксе, а также продукты EpiDermTM (EPI-200), SkinEthicTM RHE и epiCS®. Именно эти коммерческие тест-системы на основе кератиноцитов человека рекомендовано использовать в качестве объекта испытаний химической продукции согласно методикам OECD. Однако вышеперечисленные тест-системы имеют короткий срок использования (до трех дней с момента их получения производителем), что делает проблематичным их доставку в РФ, а также высокую рыночную стоимость (до 500 евро за один 96-луночный планшет с готовыми клеточными моделями). Очевидно, что разработка валидированных моделей реконструированной кожи человека непосредственно исследователями, проводящими сертификационные испытания в соответствии с утвержденными методами (ГОСТ 32634-2014), проблематична в части обеспечения стандартизации исследований, что может привести к снижению достоверности результатов испытаний.
Таким образом, внедрение современных методик оценки безопасности химической продукции для здоровья человека в РФ in vitro определяет необходимость разработки отечественных тест-систем, пригодных для этих целей.

Основная область применения ожидаемых результатов – сертификационные испытания безопасности химической продукции в отношении здоровья человека. Разрабатываемая тест-система предназначена для использования в качестве объекта испытаний при проведении исследований в соответствии с ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro».
Другие возможные сферы применения разрабатываемой тест-системы:
1) сертификационные испытания безопасности косметической продукции;
2) доклинические исследования безопасности лекарственных средств, предназначенных для наружного применения;
3) экологический мониторинг;
4) санитарно-гигиеническое нормирование и обоснование безопасных уровней содержания химических веществ и их смесей;
5) технолого-биологический контроль качества природоохранных мероприятий и процессов очистки выбросов в окружающую среду.
Возможность и условия применения разрабатываемой тест-системы по данным направлениям должна быть уточнена в результате проведения тематических ПНИ(ЭР).
Внедрение в практику сертификационных испытаний химической продукции разрабатываемых методических рекомендации по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы, повысит информативность сертификационных испытаний (за счет получения возможности оценивать видоспецифические для человека риски воздействия химической продукции на организм), сократит их продолжительность, снизит себестоимость, позволит уменьшить количество лабораторных животных, используемых в тестах in vivo, что будет способствовать гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в области безопасного обращения химической продукции. После завершения проекта Консорциум Исполнителей планирует инициировать процедуру экспертной оценки информативности разработанных методических рекомендаций с целью решения вопроса о придании ей статуса нормативной национальной методики.

1. Выполнен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках НИР.
2. Проведены патентные исследования.
3. Разработан протокол получения клеточного компонента тест-системы (ККТС) на основе иммортализованных клеток.
4. Наработаны экспериментальные образцы ККТС на основе иммортализованных клеток для экспериментальных испытаний.
5. Экспериментально обоснован выбор контрольных веществ тест-системы (КВ) с использованием ККТС на основе иммортализованных клеток.
6. Проведены испытания экспериментальных образцов на соответствие требованиям ТЗ.
7. Обоснован выбор тестируемых веществ.