Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка и создание метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза и оценка его эффективности в репликативных межпопуляционных исследованиях

Номер контракта: 14.613.21.0006

Руководитель: Собенин Игорь Александрович

Должность: ведущий научный сотрудник

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, митохондриальный геном, мутации, предрасположенность, диагностика, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Цель проекта:
1) Проект направлен на изучение генетической предрасположенности к развитию атеросклероза, обусловленной мутациями митохондриального генома. 2) Целями проекта являются разработка метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза на основе измерения суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома путем определения степени гетероплазмии по ряду мутаций митохондриальной ДНК – генетических маркеров атеросклероза; разработка лабораторного образца диагностического набора для определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК в составе метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза; проведение репликативных исследований для оценки эффективности метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза.

Основные планируемые результаты проекта:
Ключевой задачей проекта является разработка и создание метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза, а основной научно-технической задачей - разработка диагностического набора для определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК с целью использования в составе диагностического метода.
Такой диагностический набор будет использован в диагностике генетической предрасположенности к атеросклерозу путем измерения суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома. В основе диагностики будет лежать определение степени гетероплазмии по ряду мутаций митохондриальной ДНК – генетическим маркерам атеросклероза. К настоящему времени установлено, что несколько мутаций митохондриального генома сопряжены с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, но наиболее эффективные маркеры до сих пор не идентифицированы; соответственно, методов эффективной диагностики до сих пор не существует. В рамках проекта планируется проведение исследований, направленных на идентификацию генетических маркеров, имеющих диагностическую ценность в определении индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу, а также на разработку диагностических средств с целью совершенствования алгоритмов для диагностики и оценки наследственной предрасположенности.
В результате выполнения проекта российским партнером на ограниченной выборке будут идентифицированы точечные мутации митохондриального генома клеток крови человека – генетических маркеров предрасположенности к атеросклерозу - с использованием технологии полногеномного секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS), а также создан лабораторный образец диагностического набора на основе анализа гетероплазмии митохондриальной ДНК с помощью ПЦР-РВ в качестве научно-технического задела для дальнейших разработок.
Поскольку вариабельность митохондриального генома может зависеть от этнических характеристик населения, для верификации эффективности генодиагностики атеросклероза требуется проведение репликативных исследований. В рамках проекта такие исследования выполняются на пяти независимых выборках, сформированных случайным образом в Москве (300 человек, российская популяция), и иностранными партнерами – в Алматы, Ташкенте, Полтаве, Минске. Апробация метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза, проведенная на этнически разнородных популяциях, подвергающихся гетерогенному воздействию социально-экономических и средовых факторов, позволит оптимизировать диагностический алгоритм и выявить наиболее существенные независимые генетические маркеры атеросклероза.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
К настоящему времени установлено, что несколько мутаций митохондриального генома сопряжены с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, но наиболее эффективные маркеры до сих пор не идентифицированы; соответственно, методов эффективной диагностики до сих пор не существует. Надежды некоторых экспертов на грядущее в ближайшие несколько лет широкое распространение и значительное снижение стоимости полногеномного секвенирования митохондриальной ДНК являются необоснованными. Несомненно, что генотипирование методом полногеномного сиквенса полностью устранит необходимость в разработке средств и способов выявления отдельных клинически значащих мутаций. Но ни при каких условиях полногеномное секвенирование не станет ни массово доступным, ни экономически выгодным для скрининга лиц, генетически предрасположенных к сердечно-сосудистым заболеваниям, в основе которых лежит атеросклероз. Поэтому наиболее правильным научно-техническим решением проблемы является выявление наиболее значимых мутаций и их сочетаний и последующая разработка дешевых и доступных методов генодиагностики; приемлемыми технологическими подходами являются диагностикумы на основе ПЦР-РВ и фокусированные микрочипы.
Диагностика индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу путем измерения суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома на основе определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК будет способствовать более качественному определению индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений и последующей разработке персонализированной стратегии профилактики.
Последовательными задачами, решаемыми в рамках проекта, являются идентификация генетических маркеров мутационной нагрузки митохондриального генома, ассоциированных с атеросклерозом, с использованием технологии секвенирования следующего поколения на платформе Roche 454; определение состава диагностического набора, основанного на анализе гетероплазмии митохондриальной ДНК с помощью ПЦР-РВ для определения индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу. Для решения первой задачи исследования проведено секвенирование митохондриальной ДНК клеток крови 70 человек, включая как здоровых лиц без клинических проявлений атеросклероза, так и больных субклиническим или манифестировавшим атеросклерозом. Для количественной диагностики атеросклероза использовано ультразвуковое сканирование бассейна сонных артерий в режиме высокого разрешения. Определена вариабельность митохондриального генома клеток крови, а также идентифицирован спектр точечных гетероплазмичных несинонимичных мутаций митохондриального генома клеток крови, ассоциированных с атеросклерозом. В результате будет разработан перечень из 20-25 мутаций - кандидатов на включение в состав диагностического набора для определения генетической предрасположенности к атеросклерозу. Критерием включения будет объяснение не менее 5% вариабельности атеросклероза. Для этих мутаций будут разработаны праймеры и зонды для ПЦР-РВ (в том числе, LNA-зонды), предназначенные для количественного определения степени гетероплазмии митохондриального генома клеток крови по мутациям, обладающим высокой диагностической значимостью в отношении индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу. В результате будет получен лабораторный образец диагностического набора для измерения степени гетероплазмии митохондриальной ДНК методом ПЦР-РВ. В состав набора будут входить праймеры и TaqMan-зонды, а также положительные контрольные образцы – синтетические последовательности фрагментов митохондриальной ДНК, содержащий анализируемый полиморфный сайт. Для мутаций, локализованных в высокомутабельных участках митохондриальной ДНК с высокой плотностью мутаций, будут использованы LNA-зонды. Далее выборка обследуемых лиц должна быть расширена до 300 человек, после чего будет проведена оценка диагностических и технических характеристик разработанного диагностического набора в условиях кросс-секционного клинического исследования. Выборка составит 300 образцов ДНК, полученных от 300 человек, включая здоровых лиц без клинических признаков ишемической болезни сердца (150 человек) и больных ишемической болезнью сердца (150 человек), в том числе, с перенесенным инфарктом миокарда (не менее 50 человек). Участники исследования будут охарактеризованы по следующим факторам риска ишемической болезни сердца: пол, возраст, индекс массы тела, артериальное давление, курение, полный липидный профиль сыворотки крови (общий холестерин, холестерин липопротеидов низкой плотности, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды, липидный индекс атерогенности). Участники исследования также будут охарактеризованы по расчетному риску ишемической болезни сердца по Фрамингемскому алгоритму и по расчетному риску инфаркта миокарда по Мюнстерскому алгоритму. Будет проведена количественная диагностика атеросклероза методом ультразвукового сканирования сонных артерий с последующим измерением толщины интимо-медиального комплекса с использованием специализированного программного обеспечения. Будет проведено генотипирование по анализируемым мутациям с использованием разработанного лабораторного образца диагностического набора на основе технологии ПЦР-РВ. По результатам кросс-секционного клинического исследования будут определены диагностически значимые мутации митохондриального генома, будет выполнена оценка диагностических характеристик лабораторного образца диагностического набора, а также определены технические характеристики диагностического набора, в том числе, условия и технические средства, обеспечивающие проведение измерений. На основании результатов оценки будет определен окончательный состав диагностического набора с ожидаемым количеством информативных генетических маркеров от 10 до 15.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Областями применения полученных результатов или созданной на их основе инновационной продукции являются медицина, здравоохранение, профилактические программы. Результаты выполнения проекта могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями в сотрудничестве с производственными компаниями для проведения ОКР/ОТР, направленных на создание методик и аппаратно-программных комплексов для диагностики, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, разработки геномных и постгеномных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в сотрудничестве с производственными компаниями, создания технологий лечения бессимптомного атеросклероза. Использование метода ПЦР-диагностики генетической предрасположенности к ишемической болезни сердца и атеросклерозу будет способствовать более качественному определению индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений и последующей разработке персонализированной стратегии профилактики. Предлагаемый подход к диагностике предрасположенности к атеросклерозу позволит определить новые виды и сочетания биомаркеров, которые, наряду с традиционными факторами риска, помогут идентифицировать пациентов, имеющих высокий риск развития атеросклеротических заболеваний и провести своевременные профилактические мероприятия. Ранняя эффективная профилактика атеросклеротических заболеваний приведет к снижению заболеваемости и сердечно-сосудистой смертности.

Текущие результаты проекта:
Выполнен аналитический обзор информационных источников, в котором оценена возможная роль мутаций митохондриального генома в развитиии атеросклероза и патогенетические механизмы, обусловливающие эту связь. Установлено, что использование полиморфизмов (точечных мутаций) митохондриального генома и показателя суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома в качестве генетических маркеров атеросклероза и предрасположенности к развитию атеросклероза является оправданным. Описаны уже известные мутации мтДНК, ассоциированные с атеросклерозом. Установлено, что перечень известных мутаций является очень ограниченным, что обосновывает необходимость поиска новых генетических маркеров. Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011–96. Установлено, что открытыми и наиболее перспективными для патентования следует считать области, связанные с созданием таких объектов, как метод диагностики атеросклероза, основанный на оценке вариабельности и суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома, и метод диагностики предрасположенности к атеросклерозу с использованием генотипических маркеров.Выполнено обоснование разработки и создания метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза. Определено, что в качестве генетических маркеров предрасположненности к атеросклерозу следует использовать показатели гетероплазмии митохондриального генома по ряду мутаций, а также расчитанную на основе этих данных суммарную мутационную нагрузку митохондриального генома. Поскольку вариабельность митохондриального генома может зависеть от этнических характеристик населения, обоснована необходимость проведения репликативных исследований для верификации эффективности генодиагностики атеросклероза.Проведены теоретические исследования процессов измерения величин в биологических пробах и отдельных факторов, влияющих на качество результатов диагностики при полногеномном секвенировании митохондриального генома и генотипировании митохондриальной ДНК на основе технологии ПЦР-РВ с использованием зондов типа TaqMan.
Разработан план создания метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза с учетом требований ГОСТ Р 53434-2009. Разработаны принципы применения результатов ПНИ, в том числе, определены условия и технические средства, обеспечивающие проведение измерений. Разработаны технические решения, которые заключаются в разработке метода оценки митохондриальных мутаций на основе технологии мультиплексной ПЦР-РВ с использованием зондов типа TaqMan. Путем полногеномного секвенирования митохондриальной ДНК из клеток крови участников исследования определен примерный перечень из 25 вариантов (мутаций) мтДНК, ассоциированных с атеросклерозом, при этом выявлены ранее неизвестные варианты мтДНК, ассоциированные с атеросклерозом. Для выявленных мутаций разработаны праймеры, зонды и синтетические контрольные последовательности нуклеотидов, воспроизводящие фрагменты митохондриальной ДНК. Проведено математическое моделирование праймеров и зондов для оценки степени гетероплазмии мтДНК по исследуемым мутациям. Определен способ расчета расчета процента мутантного ампликона (показателя степени гетероплазмии по определяемой мутации или варианту мтДНК) с использованием одной пары праймеров для амплификации фрагмента мтДНК, содержащего анализируемый сайт, двух зондов, различающиеся по способности гибридизации с диким или мутантным участком мтДНК, а также по комбинации флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции, и синтетических контрольных последовательностей, воспроизводящих анализируемые фрагменты мтДНК для постановки контрольной пробы. При этом способе используют номера пороговых циклов Ct для кривых плавления зондов, комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК, и вычисляют значение ΔCt (разность пороговых циклов для кривых плавления зондов, комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК). В разработанном методе долю полиморфного аллеля (G%) рассчитывают по формуле G%=1/(1+ЕΔCt). Оптимизация способа расчета доли мутантного фрагмента митохондриальной ДНК заключается в том, что учитывают эффективность амплификации для каждого эксперимента. Теоретический коэффициент амплификации равен 2, но в реальных условиях он меньше и варьирует в пределах от 1,85 до 1,96. Поэтому коэффициент эффективности амплификации вычисляют по формуле Е=(R2/R1)(1/ΔCt), где R1 и R2 – уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы. Разработанный метод оценки митохондриальных мутаций основан на анализе кривых плавления зонда с использованием второй производной логистической функции и является оригинальным решением, ранее не использовавшимся в мировой науке. Разработанный метод оценки митохондриальных мутаций даёт возможность получить количественные измерения, по точности превышающие другие способы измерений, применяемые в мировой науке. Среднее значение коэффициента амплификации составило 1,92, что полностью соответствует международным стандартам для ПЦР-лабораторий. Проведен скрининг здоровых лиц и лиц с атеросклерозом из российской популяции; в исследование включено 300 участников, у которых проведено количественное УЗИ сонных артерий, получена коллекция образцов крови, проведена оценка фенотипа (традиционных факторов риска, лабораторных и инструментальных маркеров). Разработан количественный метод оценки митохондриальных мутаций. Разработан лабораторный регламент изготовления диагностического набора для определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК.