Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка мультифункциональных наноконструкций на основе модифицированных форм альбумина для детекции и лечения рака

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
нано-биотехнология, нанокомпозит, наномедицинская тераностика, здоровье человека и рак

Цель проекта:
Разработка универсальной платформы для создания инновационных противоопухолевых препаратов является одним из приоритетных направлений современной фармации. Когда речь заходит об онкологии, всегда встают два основных вопроса: терапия и диагностика. Тераностика – развивающаяся область интегральной медицины, сочетающая в себе терапию и диагностику, когда врачи используют одну технологию и для диагностики, и для лечения заболевания в ходе общей процедуры. Сведение воедино, т.е. в пределах одной наноконструкции, блоков, обеспечивающих одновременно и терапевтический эффект, и визуализацию, является необходимым условием разработки инновационных противоопухолевых препаратов. Для прогресса клинической химиотерапии, помимо создания новых препаратов для тераностики злокачественных опухолей, важное значение имеет также выбор мишени для таргетной терапии рака. Для опухолевых клеток характерно повышенное потребление глюкозы, а высокая скорость гликолиза приводит к неферментативному гликированию белков и, как следствие, к карбонильному стрессу. Недавние исследования показали генотоксические эффекты острого карбонильного стресса, что может влиять на различные патологические состояния, включая рак. В связи с этим становится очевидной особая актуальность исследования роли конечных продуктов гликирования белков в патогенезе рака с точки зрения выбора потенциальной мишени для противоопухолевой терапии. Цели проекта – разработка методологических подходов для установления роли конечных продуктов гликирования белков в патогенезе рака и развитие методологии получения мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей.

Основные планируемые результаты проекта:
Основным результатом проекта, определяющим его место и роль в решении проблем фармацевтической тераностики, будет разработка оригинальных мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей, обладающих широким спектром полезных фармакологических свойств.

В рамках данного проекта предполагается развить методологию получения мультифункциональных наноконструкций, перемещение которых можно будет отслеживать в режиме реального времени при помощи магнитно-резонансной томографии, и которые будут «обучены» выслеживать раковые клетки, помечая их магнитно-резонансной меткой, и уничтожать их посредством запрограммированного высвобождения химиотерапевтического препарата и фототермотерапии.

Функциональная аннотация конечных продуктов гликирования белков при раке, осуществляемая в рамках проекта партнером из Индии, будет оригинальным результатом в области молекулярной медицины, который будет способствовать рациональному дизайну белка-транспортера при решении партнером из России задачи создания терапевтических наноконструкций с направленным транспортом действующей субстанции.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате выполнения проекта предполагается установить роль конечных продуктов гликирования в патогенезе рака и развить методологию получения на основе модифицированных форм сывороточного альбумина мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей. Отличительной особенностью этих конструкций будет возможность реализации на их основе технологий адресной доставки лекарств к опухолевым клеткам и получения 19F-изображений в МРТ-анализе, а также увеличение терапевтического эффекта за счет одновременного воздействия на опухоль двух типов терапии – химиотерапии и фототермотерапии. Мультифункциональные наноконструкции будут разрабатываться исполнителями проекта из России на основе модифицированных форм альбумина, и исследоваться на цитотоксичность и противоопухолевую активность с использованием опухолевых моделей, разработанных на базе Центра коллективного пользования «SPF-виварий ИЦиГ СО РАН», и на моделях, создаваемых исполнителями проекта из Индии. Свойства разрабатываемых моделей должны быть наиболее приближены к свойствам отдельных опухолей человека – клеточным линиям или ксенографтам (гетеротрансплантатам) опухолей человека, растущим у иммунодефицитных мышей.

Разрабатываемая тема соответствует мировому уровню, поскольку нацелена на создание противоопухолевых препаратов нового поколения – эффективных и селективных мультифункциональных наноконструкций для тераностики злокачественных опухолей, конкурентоспособных на мировом рынке. Рынок препаратов для диагностики рака и таргетных противоопухолевых средств развивается стремительно. Тем не менее, в мировой практике на сегодняшний день нет прямых аналогов продукции, разрабатываемых в данном проекте – об этом свидетельствует анализ патентов, проведенный по этой тематике на сайтах патентных ведомств США, Японии, Германии, Дании, Франции, Канады, Китая, Южной Кореи и др. Большинство современных нанотерапевтических систем касается ограниченного числа препаратов, разрешенных к применению, таких как паклитаксел и доксорубицин. С использованием данных фармацевтических субстанций разработаны наноконструкции на основе альбумина для тераностики: препараты с альбумином, агрегированные с 99mTc для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (single-photon emission computed tomography, SPECT), PulmiteR and NanocollR, и препараты, несущие альбумин-связанные хелаты гадолиния для магнитно-резонансной томографии (МРТ), AblavarR. SPECT имеет меньшее пространственное разрешение, чем МРТ и использует ионизирующее излучение. С помощью метода МРТ можно легко регулировать контраст получаемого изображения и количественно определять различные вещества в динамике in vivo. Однако в случае ковалентных альбумин-связанных хелатов гадолиния, таких, например, как альбумин-(Gd-DTPA)30, длительное время циркуляции ковалентно-связанного Gd-DTPA увеличивает вероятность высвобождения высокотоксичного Gd3+ из комплекса в кровеносное русло. Этот фактор риска ограничивает использование альбумин-(Gd-DTPA)30 и его аналогов в преклинических исследованиях. Выбор исполнителями проекта для визуализации в качестве репортёрной группы фторорганических соединений обусловлен высокой чувствительностью ЯМР на ядрах фтора (19F) и оптимальным соотношением сигнала и шума за счет крайне низкого содержания фтора в живых организмах. Сведение воедино, т.е. в пределах одной молекулы, белка-транспортера с 19F ЯМР меткой и фармацевтической субстанции – фторпиримидина и применение метода ЯМР спектроскопия in vivo обеспечат, с одной стороны, контроль доставки наноконструкций к клеткам мишени, а с другой, позволят исследовать на уровне организма фармакокинетику и метаболизм мультифункциональных терапевтических наноконструкций.

Достижения последних лет в областях молекулярной биологии, генетики свидетельствуют, что рост и развитие опухолей контролируется сложными многофакторными процессами. Современный уровень понимания этих процессов обладает крайне низкой прогностической способностью. Тем не менее, несмотря на полную непредсказуемость результатов, работы по созданию новых лекарственных препаратов в России и других странах мира продолжаются. Для снижения риска получения отрицательных результатов при проведении биологических испытаний, исполнителями проекта предполагается разработать не менее трех экспериментальных образцов мультифункциональных наноконструкций.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Полученные при выполнении проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также при производстве лекарственных средств, совмещающих терапевтические и диагностические свойства в одной молекуле, и в практическом здравоохранении. В перспективе можно рассчитывать на масштабное позиционирование на мировом рынке Российской продукции для тераностики, поскольку существует устойчивая тенденция увеличения масштабов спроса в области использования наноконструкций в терапии и диагностики раковых заболеваний. Внедрение в медицину разрабатываемых мультифункциональных наноконструкций должно привести к снижению риска смертности онкологических больных.

На результаты интеллектуальной деятельности, полученные в рамках выполнения проектов, предполагается получить не менее трех патентов. Полученные научные результаты, будут представлены на Международных и Российских конференциях по нанотехнологии и наномедицине. По результатам исследований и разработок планируется опубликовать 6 статей в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных «Сеть науки» (Web of Science). Результаты будут включены в курсы лекций по биоорганической химии и биохимии для студентов и аспирантов Новосибирского государственного университета. Планируется подготовить к защите диссертации по разрабатываемой теме не менее двух молодых исполнителей проекта.

Текущие результаты проекта:
В основе методологии научных исследований 2015 г. лежала оценка возможных вариантов дизайна и получения лиганд-ориентированных мультифункциональных наноконструкций на основе модифицированных форм человеческого сывороточного альбумина для тераностики злокачественных опухолей. Работы выполнялись в тесном взаимодействии с партнерской командой ученых из Индии.

Исполнителями проекта выполнена функциональная аннотация биомаркеров, специфичных к рецепторам клеток злокачественных опухолей, по результатам которой сделан вывод, что транспортные молекулы для доставки лекарств к клеткам-мишеням должны индуцировать опосредованный рецепторами эндоцитоз. Обнаружено, что сывороточный альбумин может быть сам лигандом к рецепторам, уровень экспрессии которых повышен в раковых клетках. Модификация альбумина влияет на связывание белка рецепторами и эффективность накопление его опухолевыми клетками. Исполнителями проекта из Индии в отчетный период исследовано воздействие гликированного сывороточного альбумина на линию клеток рака легких A549 и показано, что при инкубации с гликированным альбумином, уровень продуктов позднего гликирования (CML и пентозидина) возрастает в 3 раза по сравнению с их уровнем в клетках линии A549, инкубированных в отсутствии модифицированного белка. Это указывает на то, что при разработке терапевтических наноконструкций необходимо учитывать, что модификация альбумина может повлиять как на способность белка связываться рецепторами, обеспечивающими транспорт наноконструкции в опухолевые клетки, так и на протекание внутриклеточных процессов. Разрабатываемые подходы к получению лиганд-ориентированных молекул-транспортеров на основе модифицированных форм альбумина, а также методы декорирования белка ЯМР метками 19F и конъюгирование его с противоопухолевым препаратом не должны приводить к нарушению конформации белка, обеспечивающей его сродство к определенным типам рецепторов. Для решения проблемы селективной доставки лекарства и его накопления в опухоли, в белок-транспортер целесообразно вводить остаток биотина, обеспечивающий взаимодействие с рецепторами, сверхэкспрессия которых критична для выживания опухолевых клеток различных тканей.

В отчетный период исполнителями проекта из России разработана лабораторная методика получения мультифункциональных наноконструкций для тераностики, включающая:
а) метод декорирования человеческого сывороточного альбумина стабилизатором стерической конфигурации (ПЭГ) и адресной молекулой (биотин);
б) метод конъюгирования через рН-лабильную связь противоопухолевого фтормеченного нуклеотида с лиганд-ориентированным белком-транспортером;
в) метод введения 19F ЯМР метки в человеческий сывороточный альбумин;
г) метод иммобилизации на поверхности золотых наночастиц мультифункциональных наноконструкций.

Модифицированные формы человеческого сывороточного альбумина и отдельные структурные элементы мультифункциональных наноконструкций, полученные с использованием разработанных исполнителями методов, исследованы на чистоту с помощью колоночной жидкостной хроматографии (гликированный альбумин, низкомолекулярные соединения) и гель-электрофореза (модифицированные белки) и, согласно физико-химическим характеристикам (электронная спектроскопия, ЯМР на разных ядрах, ИК спектроскопия, масс-спектрометрия, гель-электрофорез, анализ функциональных групп), содержат в структуре 19F ЯМР метку, стабилизатор стерической конфигурации (полиэтиленгликоль), биомаркер (биотин) и терапевтический нуклеотид. Результаты проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии указывают на то, что мультифункциональные наноконструкции с высокой эффективностью поглощаются опухолевыми клетками.

В результате выполнения проекта в отчетный период получены результаты, способные к правовой охране, а именно: разработан метод введения 19F ЯМР метки в человеческий сывороточный альбумин. По данным результатам подана заявка на изобретение №2015132581 от 04.08.2015.

Впервые, исполнителями проекта из России на основе альбумина получен бимодальный молекулярный зонд, детектируемый с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) и магнитно-резонансной спектроскопии на ядрах 19F. С его использованием проведены исследования на мышах SPF-статуса линии SCID с опухолью головного мозга, вызванной внутричерепной инъекцией клеточной культурой глиомы U87 человека, и показана возможность визуализации глиомы методом 19F МРТ.

Исполнителями проекта из Индии разработаны опухолевые модели экспериментальных животных (самцы швейцарских мышей-альбиносов с раком легких), с использованием которых были проведены эксперименты по определению уровня конечных продуктов гликирования (CML, пентозидина и аргпиримидина) в раковых тканях легких. На основании полученных данных был сделан вывод, что продукты поздней стадии гликирования играют неоспоримую роль в протекании канцерогенеза.

Публикации по результатам, полученным в отчетный период:
1. Chubarov, A. S.; Zakharova, O. D.; Koval, O. A.; Romaschenko, A. V.; Akulov, A. E.; Zavjalov, E.L.; Razumov, I. A.; Koptyug, I. V.; Knorre, D. G.; Godovikova, T. S. Design of protein homocystamides with enhanced tumor uptake properties for 19F magnetic resonance imaging // Bioorg. Med. Chem. – 2015. – Vol. 23. – N. 21. – P. 6943–6954.

2. Ashraf, J. M.; Ahmad, S.; Choi, I.; Ahmad, N.; Khan, M. F.; Godovikova, T.; Shahab, U. Recent advances in detection of AGEs: Immunochemical, Bioanalytical and Biochemical approaches // IUBMB Life – 2015 accepted for publication.

Отдельные результаты работы были представлены на Международной конференции и опубликованы в материалах конференции:
1. Silnikov, V. N.; Ahmad, S.; Godovikova, T. S. Multifunctional nanoassemblies of therapeutic nucleotides: from design validation to theranostic nanomedicine // International conference on biotechnological advances in free radical biology and medicine (ICBAFM-2015), Integral University, Lucknow, India. – 2015. – P. 26.

2. Antonova, N. M.; Chubarov, A. S.; Godovikova, T.S. Multimodal tumor-targeting imaging probes: design and applications // International conference on biotechnological advances in free radical biology and medicine (ICBAFM-2015), Integral University, Lucknow, India. – 2015. – P. 66.

3. Popova, T. V.; Lisitskiy, V. A.; Godovikova, T. S. Trifluorothymidine-linoleic acid conjugates: potential for improved chemotherapy // International conference on biotechnological advances in free radical biology and medicine (ICBAFM-2015), India, Integral University, Lucknow, India. – 2015. – P. 51.