Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание методики неинвазивной диагностики новорожденных по анализу выдыхаемого воздуха методами масс-спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения

Номер контракта: 14.613.21.0025

Руководитель: Франкевич Владимир Евгеньевич

Должность руководителя: заведующий отделом

Докладчик: Стародубцева Наталия Леонидовна, заведующая лабораторией

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Организация докладчика: федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
неонатология, медицинская диагностика, масс-спектрометрия, прямая масс-спектрометрия, протеомика, метаболомика, идентификация молекул.

Цель проекта:
1. Создание метода экспресс-идентификации и диагностики состояния новорожденных детей, основанный на анализе молекулярного состава выдыхаемого воздуха в режиме реального времени (без пробоподготовки), базы данных молекулярных профилей. 2. Разработка алгоритмов идентификации патологических изменений состояния новорожденных детей с использованием разработанного метода.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Краткое описание основных научных и научно-технических результатов, подлежащих получению при выполнении научных исследований.
1.1 Отчет о научных исследованиях, содержащий в том числе:
а) обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по теме исследования;
б) результаты сравнительной оценки вариантов решения научной проблемы и обоснование выбора оптимального варианта направления исследований;
в) изложение методик проведения исследований;
г) результаты экспериментальных исследований в том числе:
—описание подходов к экспресс-анализу состава выдыхаемого воздуха масс–спектрометрическими и биоинформатическими методами.
—результаты экспресс мониторинга здоровых детей для создания базы данных биомаркеров выдыхаемого воздуха.
—результаты мониторинга новорожденных детей (1-10 сутки жизни) с различными легочными патологиями.
—описание метода исследования механики дыхания и легочного газообмена, дифференциальной диагностики врожденной пневмонии и респираторного дистресс-синдрома, ранней диагностики бронхолегочной дисплазии, почечной недостаточности и ряда других заболеваний.
д) технико-экономическую оценку результатов научных исследований;
е) обобщение и выводы по результатам научных исследований;
ж) предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов научных исследований
1.2 Отчет о патентных исследованиях в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
1.3. Стандартные операционные процедуры (СОП):
1.3.1 Забор выдыхаемого воздуха у взрослого пациента;
1.3.2. Забор выдыхаемого воздуха из инкубатора;
1.4 Методика экспресс-мониторинга состояния новорожденных, находящихся на выхаживании в инкубаторах, на основе анализа молекулярного состава выдыхаемого воздуха.
1.6 Методики ионизации образцов выдыхаемого воздуха.
1.8 Программное обеспечение для анализа масс-спектрометрических данных.
1.9 Программного обеспечение для идентификации лекарственных препаратов по анализу полученных масс-спектров и экспресс диагностики.
1.10 Базы данных молекулярных профилей (масс-спектров) и других характеристик молекулярного состава выдыхаемого воздуха новорожденных на разных стадиях развития и с различными патологиями.
1.11 Техническое задание на выполнение ПНИЭР по теме: «Разработка устройства, позволяющего диагностировать состояние новорожденного ребенка по анализу выдыхаемого воздуха в режиме реального времени по масс-спектрометрическим профилям выдыхаемого воздуха с использованием базы данных»
1.12 Экспериментальный образец ионизационного модуля (ионного источника) для регистрации молекулярных профилей выдыхаемого воздуха, обеспечивающий работу с масс-спектрометром, оснащенным атмосферным интерфейсом ввода ионов.
1.13 Экспериментальный образец системы отбора проб выдыхаемого воздуха.
1.14 Экспериментальный образец аппаратно-программного комплекса для мониторинга состава выдыхаемого воздуха у новорожденных детей.
1.15 Прототип портативного масс-спектрометра для анализа выдыхаемого воздуха, включая ионизационный источник, ионную оптику, ионный детектор, пользовательский интерфейс.
1.16 Перечень биомаркеров для оценки состояния новорождённых.
1.17 Заявки на получение охранных документов (патентов).
1.18 Публикации по результатам исследований и разработок в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (Web of Science).

2. Основные характеристики планируемых результатов, научной (научно-технической, инновационной) продукции.

2.1. Должен быть выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках научных исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты) - не менее 75 научно-информационных источников за период 2004 – 2014 гг. 3.2 Должны быть проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
2.3. Должны быть исследованы, обоснованы и выбраны методы и средства, направления исследований и способы решения поставленных задач, а именно:
— по составу и содержанию исследовательских и аналитических работ;
— по составу и содержанию теоретических исследований и разработке прототипов технических, программных, технологических решений;
2.4 Должны быть разработаны стандартные операционные процедуры (СОП):
2.4.1 Забора выдыхаемого воздуха у взрослого пациента;
2.4.2 Забора выдыхаемого воздуха из инкубатора;
2.5 В рамках проекта должны быть разработаны и изготовлены экспериментальные образцы:
2.5.1 Ионизационного модуля (ионного источника) для регистрации молекулярных профилей выдыхаемого воздуха (не менее 1 шт)
2.5.2 Системы отбора проб выдыхаемого воздуха (не менее 1 шт).
2.5.3 Аппаратно-программного комплекса для мониторинга состава выдыхаемого воздуха у новорожденных детей (не менее 1 шт).
2.6 Должно быть разработано программное обеспечение:
2.6.1 для анализа масс-спектрометрических данных (не менее 1 шт).
2.6.2 для идентификации лекарственных препаратов по анализу полученных масс-спектров и экспресс диагностики (не менее 1 шт).
2.7 Разработанное программное обеспечения должно однозначно определять конкретный тип биомаркера, работать на базе персонального компьютера, соответствовать ГОСТ 19.501-78.
2.8 Должны быть разработаны методики ионизации образцов выдыхаемого воздуха, дающих воспроизводимые масс-спектры, однозначно идентифицирующие молекулярный состав выдыхаемого воздуха.
2.9 Должен быть проведен сравнительный анализ методов отбора проб выдыхаемого воздуха для их последующего исследования методами масс-спектрометрии.
2.10 Должен быть разработан стандартный протокол проведения эксперимента, включающий в себя такие параметры как:
2.7.1.1. технические параметры прибора
2.7.1.2. физиологические особенности пациента
2.7.1.3. временные параметры эксперимента
2.11 Должны быть проведены работы по проектированию ионизационного модуля (ионного источника) для регистрации молекулярных профилей выдыхаемого воздуха, обеспечивающий работу с масс-спектрометром, оснащенным атмосферным интерфейсом ввода ионов.
2.12 Должны быть проведены расчеты технических параметров разрабатываемого ионного источника.
2.13 Должны быть проведены работы по выбору типа масс-спектрометра, необходимого для проведения исследований в рамках научных исследований.
2.14 Должны быть проведены работы по сопряжению ионного источника с атмосферным интерфейсом масс-спектрометра.
2.15 Должен быть определен класс химических соединений, по которому будет проводиться идентификация состояния новорождённых:
2.15.1. Должны быть определены заболевания, которые могут быть идентифицированы данным прибором, включая заболевания легких.
2.16 Должны быть разработаны новые подходы к классификации состояния новорожденных по масс-спектрам продуктов их прямой ионизации. 2.17 Должна быть разработана база данных, позволяющая проводить однозначную идентификацию состояния новорожденных, а также давать информацию для постановки и(или) уточнения диагноза, в случае наличия патологий.
2.18 Для проверки результатов исследований и проверки работоспособности измерительной системы должен быть разработан модельный объект и алгоритм проверки.
2.19 В качестве модельных объектов должны быть привлечены взрослые пациенты с различными заболеваниями.
2.20 В качестве эталонных образцов должны быть использованы образцы выдыхаемого воздуха, полученные от здоровых людей (в количестве не менее 10 человек).
2.21 Забор воздуха должен быть осуществлен в одинаковых условиях для каждого пациента, включая время забора, объем выдыхаемого воздуха.
2.22 Должны быть проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов и программного обеспечения в соответствии с программой и методиками исследовательских испытаний.
2.23 Должна быть сформирована и охарактеризована коллекция образцов биологического материала (выдыхаемого воздуха):
2.23.1 для диагностики болезней органов дыхания, мониторинга течения воспалительного процесса, оксидантного стресса легких, а также детектирования специфических биомаркеров бронхиальной астмы, хронической обструктивной болезни легких, бронхоэктазов, муковисцидоза, интерстициальных заболеваний легких.
2.23.2 для исследования содержания сурфактанта-A и его метаболитов в выдыхаемом воздухе.
2.24 Основными критериями при разработке прототипа портативного масс-спектрометра для анализа выдыхаемого воздуха должны быть:
2.24.1 Высокая чувствительность к соединениям, входящим в состав выдыхаемого воздуха;
2.24.2 Масс разрешение выше единичного и возможность тандемного МС анализа.
2.24.3 Легкость транспортировки и низкая стоимость по отношению к существующим аналогам;
2.24.4 Низкая стоимость обслуживания и стабильность в эксплуатации.
2.25 Требования к работам, выполняемым с участием иностранного партнера.
2.25.1. В соответствии с Соглашением о научно–техническим сотрудничестве от 15 октября 2014 г. между федеральным государственным бюджетным учреждением "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НЦАГиП им. В.И. Кулакова" и государственным бюджетным учреждением «Базовая лаборатория масс-спектрометрии провинции Цзянси» (Нанчанг, Китай) иностранным партнером за счет собственных средств (внебюджетных) будут выполнены следующие работы:
2.25.1.1 Разработка метода ионизации выдыхаемого воздуха на имеющихся у иностранного партнера приборах.
2.25.1.2 Конструирование оригинального источника ионизации для получения высокоинформативных масс-спектров, отражающих состав выдыхаемого воздуха, создание ионизационного источника, наиболее чувствительного к соединениям, входящим в состав выдыхаемого воздуха.
2.25.1.3 Выявление оптимальных операционных параметров источника ионизации с учетом параметров для неинвазивного и высокодоступного анализа новорожденных.
2.25.1.4 Адаптация коммерчески доступных типов масс-спектрометров (электростатические ионные ловушки; Орбитрэп) для анализа выдыхаемого воздуха.
2.25.1.5 Создание прототипа портативного масс-спектрометра для анализа выдыхаемого воздуха, включая ионизационный источник, ионную оптику, ионный детектор, пользовательский интерфейс и т.д., на базе коммерчески доступных типов масс-спектрометров (электростатические ионные ловушки; Орбитрэп)
2.25.1.6 Разработка метода анализа выдыхаемого воздуха с использованием портативного масс-спектрометра, а именно, выявление оптимальных операционных параметров для неинвазивного и высокодоступного анализа выдыхаемого воздуха новорожденных.
2.25.1.7 Тестирование различных модальностей масс-спектрометрического эксперимента (например: онлайн/оффлайн анализ, фармококинетический анализ, фенотипирование, диагностика.
2.25.1.8 Проведение тестовых экспериментов с условиями, приближенными к условиям клинических исследований.
2.25.1.9 Изучение механики дыхания и легочного газообмена у новорожденных, в том числе у глубоконедоношенных в критическом состоянии.
2.25.1.10 Подготовка технического задания на создание коммерческого масс-спектрометрического комплекса для анализа выдыхаемого воздуха.
2.25.1.11 Подготовка заявки на патент на использование в неонатальной практике нового портативного масс-спектрометра для анализа выдыхаемого воздуха.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. При реализации НИ будет создан опытный макет экспериментальной установки на основе масс-спектрометра, которую можно будет использовать при проведении научных исследований в медицинских исследовательских организациях. Окончательный продукт – система для неинвазивной диагностики новорожденных детей, в том числе глубоко недоношенных.
Данный комплекс позволит проводить экспресс-мониторинг состояния новорожденных, находящихся на выхаживании в инкубаторах, на основе анализа молекулярного состава выдыхаемого воздуха; развивать методики ионизации образцов выдыхаемого воздуха, как новорожденных, так и взрослых пациентов; создавать базы данных биомаркеров для оценки состояния новорождённых.
Цель проекта состоит в создании метода экспресс-мониторинга состояния новорожденных детей, основанного на анализе молекулярного состава выдыхаемого воздуха в режиме реального времени методами прямой масс-спектрометрии, позволяющими избежать сложной первичной подготовки проб, для чего решаются следующие задачи: создание базы данных молекулярных профилей и разработка алгоритмов идентификации патологических изменений в состоянии новорожденных детей, разработка подхода к исследованию состояния глубоконедоношенных детей, находящихся в критическом состоянии, создание метода исследования механики дыхания и легочного газообмена, дифференциальной диагностики врожденной пневмонии и респираторного дистресс-синдрома, ранней диагностики бронхолегочной дисплазии, почечной недостаточности и ряда других заболеваний. Реализация целей проекта позволит исследовательским и медицинским организациям получить новый инструмент – экспресс метод неинвазивного контроля и диагностики состояния новорожденных, что будет способствовать повышению качества оказываемой медицинской помощи и снижению смертности и инвалидности недоношенных пациентов среди новорожденных. Кроме того, данный проект формирует фундамент для создания нового вида продукции медицинской диагностики и развития его экспортного потенциала.
2. Анализ патентной документации и обзор научно-технической литературы по теме проекта позволяет утверждать, что используемые методики прямой масс-спектрометрии, технологические решения для разработки комбинированных ионные источников и адаптации для прямой масс-спектрометрии и программные решения для анализа молекулярного состава выдыхаемого воздуха в режиме реального времени являются новыми, перспективными, научно-обоснованными и патентоспособными.
На данный момент, основные исследования анализа дыхания делаются на базе газовой хроматографии. Экстрактивный электроспрей и экстрактивная химическая ионизация коронным разрядом в комбинации с масс детектированием ионной ловушкой позволяют онлайн контроль выдыхаемого воздуха в реальном времени.
3. Серьезной проблемой при интенсивной терапии и выхаживании недоношенных детей остаются инвазивность многих методов терапии и исследования. С этой точки зрения разработка диагностического мониторинга состава выдыхаемого недоношенными детьми воздуха методами масс-спектрометрии и оптической спектрометрии представляется весьма перспективной в плане диагностики, что будет способствовать гумманизации реанимационно-интенсивной помощи, увеличению спектра диагностических возможностей и, как следствие, увеличению выживаемости и снижению инвалидности недоношенных пациентов. Реализация целей проекта позволит исследовательским и медицинским организациям получить новый инструмент – экспресс метод неинвазивного контроля и диагностики состояния новорожденных, что будет способствовать повышению качества оказываемой медицинской помощи и снижению смертности и инвалидности недоношенных пациентов среди новорожденных. Кроме того, данный проект формирует фундамент для создания нового вида продукции медицинской диагностики и развития его экспортного потенциала.
В настоящее время исследование выдыхаемого воздуха и конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) новорожденных только начинает проводиться. Актуальным остается разработка основных методических принципов по сбору КВВ и дальнейшему анализу высокомолекулярных (белков, пептидов, липидов, жирных кислот и других компонент) и низкомолекулярных метаболитов (до 500 Да) в составе КВВ у новорожденных. анализ результатов аналогичных работ позволяет заключить, что до сих пор состав выдыхаемого воздуха исследовался только для детей, старше 5 лет (то есть данные для новорожденных и неонатального периода отсутствуют), причем среди исследуемых нозологий 95% составляют онкологические заболевания (в основном, рак легких), астма, муковисцидоз и ХОБЛ (патологии не являющиеся значимыми для неонатологии).
4. Для доведения результатов НИ до потребителей – ведущих НИИ в области неонатологии и исследователей, работающих в области биологии, планируется опубликовать результаты работы в научных и научно-популярных периодических изданиях, представить на международных и российских конференциях по масс-спектрометрии, педиатрии и биохимии.
Для доведения результатов НИ до потребителей – высокотехнологичных компаний планируется участие в выставках и научно-технологических конгрессах (например «Мир биотехнологии», «Инновации в масс-спектрометрии» и др.), а так же проведение маркетинговых исследований с обнародованием их результатов.
Результат выполненной работы ввиду своей актуальности имеет высокий потенциал внедрения в медицинскую практику после проведения ОКР. Непосредственные результаты проекта позволят создать уникальные установки, которые смогут использоваться для дальнейших разработок и исследований в медицинских исследовательских организациях неонатологического профиля и конкурировать на международных рынках (аналогов подобной технологии не имеется).

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Основным коммерчески интересным преимуществом разрабатываемого нами метода неинвазивной диагностики новорожденных по анализу выдыхаемого воздуха с использованием масс-спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения является то, что можно развивать принципиально новые методы неинвазивной ранней медицинской диагностики различных заболеваний новорожденных. Данный подход для ранней мультипараметрической диагностики патологий новорожденных, находящихся в инкубаторах, позволит разработать новые подходы персонифицированной медицины в неонатологии и терапевтическом мониторинге, что будет способствовать гуманизации реанимационно-интенсивной помощи, увеличению спектра диагностических возможностей и, как следствие, увеличению выживаемости и снижению инвалидности недоношенных пациентов. В результате применения данной методики в перинатальных центрах Российский Федерации будет снижен как срок госпитализации недоношенных пациентов, процент осложнений и связанных с ними неонатальных потерь и медицинских проблем для таких пациентов впоследствии, и, как следствие, финансовые затраты государства на выхаживание новорожденных в отделениях интенсивной терапии и реанимации.
2. Результат выполненной работы ввиду своей актуальности имеет высокий потенциал внедрения в медицинскую практику после проведения ОКР. В перспективе, окончательный продукт – система для диагностики состояния новорожденных отделения интенсивной терапии и реанимации (ОРИТН).
Создаваемый подход для ранней мультипараметрической диагностики патологий новорожденных, позволит разработать новые подходы персонифицированной медицины в неонатологии и терапевтическом мониторинге, что будет способствовать гуманизации реанимационно-интенсивной помощи, увеличению спектра диагностических возможностей и, как следствие, увеличению выживаемости и снижению инвалидности недоношенных пациентов.
3. Рыночный потенциал использования разрабатываемой платформы представляется исключительно высоким, так как подобные прецизионные методы онлайн мониторинга состояния новорожденных в мире отсутствуют. В Москве и Санкт-Петербурге насчитывается более 45 крупных гинекологических/перинатальных центров, для которых разрабатываемая диагностическая платформа представляет большой интерес.
Разрабатываемая в рамках НИ инструментальная и программная база для контроля состояния новорожденных ОРИНТ позволит персонифицировать медицину во время подбора терапии, разработки лекарственных средств, фармакокинетических исследований и подбора системы питания.
4. Результаты проекта, помимо индустриальных партнеров, могут быть использованы другими высокотехнологичными компаниями, существующими в России для создания подобных систем в интересах других областей медицины.
Для доведения результатов НИ до потребителей – ведущих НИИ в области неонатологии и исследователей, работающих в области биологии, планируется опубликовать результаты работы в научных и научно-популярных периодических изданиях, представить на международных и российских конференциях по масс-спектрометрии, педиатрии и биохимии.
Для доведения результатов НИ до потребителей – высокотехнологичных компаний планируется участие в выставках и научно-технологических конгрессах (например «Мир биотехнологии», «Инновации в масс-спектрометрии» и др.), а так же проведение маркетинговых исследований с обнародованием их результатов.
Результат выполненной работы ввиду своей актуальности имеет высокий потенциал внедрения в медицинскую практику после проведения ОКР. Непосредственные результаты проекта позволят создать уникальные установки, которые смогут использоваться для дальнейших разработок и исследований в медицинских исследовательских организациях неонатологического профиля и конкурировать на международных рынках (аналогов подобной технологии не имеется).



Текущие результаты проекта:
1) Проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме научного исследования в части разработки методики масс-спектрометрического анализа выдыхаемого воздуха. Показано, что исследования выдыхаемого воздуха новорожденных методом масс-спектрометрии в литературе не представлены, что, видимо, связано со сложностью получения таких образцов и сложностью работы с такими пациентами. Однако исследования других биологических жидкостей новорожденных проводятся, в частности, получены данные о характерных метаболомных профилях новорожденных с внутриматочной задержкой роста, асфиксией при рождении, сердечно-сосудистых нарушениях, нефроуропатиях, РДС, сепсисе, гипотермии, врожденной пневмонии, врожденных метаболомных нарушениях. На основе проведенного анализа литературных источников можно сделать вывод о необходимости проведения дальнейших исследований, для оценки потенциальных отношений между биомаркерами у инкубированных недоношенных новорожденных.
2) Созданы стандартные операционные процедуры, включающие сбор пробы конденсата выдыхаемого воздуха у взрослого пациента для исследования макромолекулярного состава и сбор пробы конденсата выдыхаемого воздуха у недоношенного ребёнка, находящегося на выхаживании в инкубаторе и подключенного к установке ИВЛ.
3) Написано программное обеспечение: «Программа обработки и анализа масс-спектрометрических данных», которая предназначена для декодирования, обработки и анализа данных, полученных методами масс-спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения. Для анализа данных используются методы кластерного анализа, сплайн-интерполяции, методы понижения размерности, главной компоненты, проводятся статистические тесты.
4) Разработан метод ионизации выдыхаемого воздуха на имеющихся приборах (электростатические ловушки LTQ). Начато конструирование оригинального источника ионизации для получения высокоинформативных масс-спектров, отражающих состав выдыхаемого воздуха создание ионизационного источника, наиболее чувствительного к соединениям, входящим в состав выдыхаемого воздуха (экстрактивный электроспрей; экстрактивная химическая ионизация коронным разрядом). Тестирование операционных параметров источника ионизации с учетом параметров для неинвазивного и высокодоступного анализа новорожденных (на базе здоровых добровольцев). Проводится адаптация коммерческого масс-спектрометра к скринингу культур болезнетворных бактерий на предмет обнаружения летучих биомаркеров (электростатические ловушки LTQ, экстрактивная химическая ионизация).
5) Проведены патентные исследования, которые показали, что на сегодняшний день материалы по исследуемым объектам опубликованы, главным образом, в непатентных источниках информации. Исследование уровня техники, с использование баз данных не обнаружило действующие патенты, таким образом, подтверждена патентная чистота полученных результатов. Источники информации и базы данных, по которым проводился поиск, позволяют утверждать, что патентный поиск, проведенный в соответствии с поставленными задачами, является полным. Задание на проведение патентного поиска выполнено полностью.
6) Создан прототип портативного масс-спектрометра для анализа выдыхаемого воздуха, включая ионизационный источник, ионную оптику, ионный детектор, пользовательский интерфейс и т.д., на базе коммерчески доступных типах масс-спектрометров (электростатические ионные ловушки) в базовой лаборатории Масс-спектрометрии и инструментального развития провинции Цзянси.Ионным детектором нового прибора является линейная электростатическая ионная ловушка. Ионизация осуществляется посредством электронного удара паров образца в вакууме.
7) Разработан метод анализа выдыхаемого воздуха с использованием портативного масс-спектрометра, а именно, выявление оптимальных операционных параметров для неинвазивного и высокодоступного анализа выдыхаемого воздуха новорожденных. В процессе разработки портативного масс-спектрометра, было принято окончательное решение использовать ионизацию электронным ударом в качестве источника ионизации. Ионизация электронным ударом принципиально отличается как от экстрактивной электроспрейной ионизации, так и от экстрактивной химической ионизации коронным разрядом. При ионизации электронным ударом ионизация газа происходит в вакууме и сопровождается фрагментацией родительских ионов, что дает доступ к структурной информации. Эта особенность особенно важна, поскольку в портативных масс-спектрометрах столкновительная диссоциация в ловушке имеет очень низкую эффективность. Ионы, образованные методами экстрактивной электроспрейной ионизации либо экстрактивной химической ионизации коронным разрядом, не фрагментируют при ионизации. Таким образом, использование этих методов было бы сопряжено с недостаточной химической специфичностью масс детекции. Помимо прочего, использование ионизации электронным ударом значительно облегчает идентификацию сигналов в масс спектре при помощи сравненительного анализа с обширной базой масс спектров, полученных электронным ударом, общедоступных в библиотеке Института Международных Стандартов (NIST).
8) Проведено тестирование различных модальностей масс-спектрометрического эксперимента (например: онлайн/оффлайн анализ, фармококинетический анализ, фенотипирование, диагностика). В частности, был протестирован оффлайн метод анализа, который позволяет удаленный анализ проб дыхания. Для накопления проб были использованы коммерчески доступные поливинилхлоридные пакеты, предназначенные для забора проб газов. Анализ оффлайн-проб дыхания проводился при помощи экстрактивной электроспрейной ионизации. Хранение образца дыхания в течение 1-2 часа мало влияет на состав пробы. Более длительное хранение приводит к загрязнению образца N, N-диметилацетамидом (DMAC), выделяющимся из пластика, что приводит к частичному подавлению сигналов дыхания. Использование оффлайн-анализа может быть использовано на начальной стадии экспериментов с новорожденными детьми для упрощения экспериментального подхода.
Проведение тестовых экспериментов с условиями, приближенными к условиям клинических исследований.
Основная задача при масс спектральном анализе недоношенных новорожденных состоит в наименьшей степени воздействия на естественные условия инкубации. Были предложены два подхода к решению данной проблеме. Первый подходом является использование длинных газовых трубок для подачи образца дыхания. Мы обнаружили, что использование нагреваемых (80 С) медных трубок с диаметром 5 мм позволяет детекцию сигнала дыхания на расстоянии 8-10 м от масс спектрометра с двукратной потерей чувствительности по сравнению с анализом на расстоянии 10 см. Второй подход состоит в использовании специальных пластиковых пакетов для забора оффлайн-проб дыхания. Этот подход позволяет транспортировку проб от стационарных пациентов к стационарному масс спектрометру. Оказалось, что 1-2 часовое хранение проб дыхания не оказывает значительного воздействия на наблюдамые сигналы. Исследованные онлайн, так и оффлайн подходы будут использоваться при дальнейших экспериментах с новорожденными детьми.
9) Проведена апробация методики диагностики заболеваний по выдыхаемому воздуху на взрослых пациентах с целью создания баз данных биомаркеров, ответственных за различные заболевания Проанализирован протеомный состав конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) 79 человек: 26 больных с диагностированным раком легкого, 17 больных ХОБЛ в стадии обострения, 13 больных с внебольничной пневмонией, 23 здоровых некурящих донора. Было выявлено более 200 различных белков. Инвариантными для всех проб являлись цитоскелетные кератины II типа (1, 2, 3, 4, 5, 6) и цитоскелетные кератины I типа (9, 10, 14, 15, 16). Среди некератиновых белков наибольшей частотой встречаемости в пробах характеризовался дермцидин – белок-антибиотик, обладающий антибактериальной и протеолитической активностями. В случае с группами здорового контроля и ХОБЛ дермцидин являлся практически инвариантным (частота встречаемости в пробах 96% и 94% соответственно), то для группы с диагнозом пневмония встречаемость этого белка резко упала до 60%. Следует отметить резкое снижение количества идентификаций предшественника альфа-1-микроглобулина / бикунина с более 80% идентификаций этого белка в пробах группы здорового контроля до порядка 10% идентификаций в пробах групп с диагнозами ХОБЛ и пневмония (таблица 2-4). Для белка SHROOM3 наблюдалась обратная динамика, характеризующаяся резким возрастанием количества идентификаций в пробах доноров с диагнозами ХОБЛ и пневмония по сравнению со здоровых контролем. Аналогичная обратная динамика (с менее выраженным ростом числа идентификаций) характерна также для динеина и дермокина. Выделена группа из 6 белков преимущественно детектируемых в КВВ больных раком легкого, а именно, бета- и альфа- субъединицы гемоглобина, изоформы ядерного убиквитинового казеина, изоформы HMG-I белка группы высокой мобильности HMG-I/HMG-Y, цДНК FLJ78440, сходная с человеческим лактоферрином. Большинство выявленных белков может быть предложено в качестве панели для диагностики рака легкого, но необходимо проведение дальнейших исследований с целью определения их диагностической значимости и роли в патогенезе рака легкого.
10) Проведен протеомный и метаболомный анализ конденсата выдыхаемого воздуха 6 новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции в отделении реанимации и интенсивной терапии НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России на разных стадиях развития и при различных патологиях. Разработан и протестирован неинвазивный метод сбора конденсата выдыхаемого воздуха новорожденных на основе коммерческого конденсора R-tube (США) с подключение к аппарату с искусственной вентиляцией легких (ИВЛ). Идентифицированы молекулярные профили белков и метаболитов, в составе выдыхаемого воздуха новорожденных на разных стадиях развития и с различными патологиями. В конденсате собранном в режиме с ИВЛ присутствует постоянный спектр инвариантных белков кератинов 1, 10, 2, 9, которые являются мажорными белками, а также минорные белковые компоненты, содержание которых вариабельно у разных пациентов и скорее всего, связано со стадией развития и патологией новорожденных.
11) Создана база данных на основе результатов исследования 6 образцов КВВ новорожденных, содержащая информацию о молекулярных профилях белков и метаболитов, в составе выдыхаемого воздуха новорожденных, находящихсяя на выхаживании в инкубаторе и подключенных к установке ИВЛ, на разных стадиях развития и с различными патологиями.
12) Было выполнен фармакокинетический эксперимент по анализу выдыхаемого воздуха с использованием прямой масс-спектрометрии (экстрактивная электроспрейная ионизация) на 20 образцах здоровых добровольцев до еды, через час и два часа после еды. Метод главных компонент (PCA) и ортогональный метод проекции на скрытые структуры выявили высокое качество полученных масс-спектрометрических данных дыхания добровольцев до и после еды в динамике и хорошую кластеризацию точек данных на графике счетов. Анализ пар временных групп каждого индивидуума позволил выявить эндогенные и экзогенные соединения, которые могут выступать в качестве потенциальных биомаркеров, соответствующих метаболитам, сопряженным с процессами поглощения и переваривания пищи. Полученные модели могут быть использованы в дальнейшем для изучения сходства и различий появления и дальнейшей кинетики метаболитов у различных организмов. С использованием разработанных в НИ программных продуктов для выявления метаболитов в выдыхаемом воздухе по масс-спектрам с характерными изменениями в динамике, была получена база веществ, наличие которых в выдыхаемом воздухе связано с процессами метаболизма, причем возможно разделение этих веществ на группу эндогенного и экзогенного происхождения. Как и ожидалось, среди метаболитов экзогенного происхождения, характерными для выдыхаемого воздуха, с процессами метаболизма ассоциированы ацетон, пропаналь, этиловый эфир молочной кислоты, метиловые эфиры жирных кислот.
13) Написано программное обеспечение: «Программное обеспечение для идентификации лекарственных препаратов по анализу полученных масс-спектров и экспресс диагностики», предназначенной для обработки и анализа данных, полученных методами масс-спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения для идентификации фармакокинетики лекарственных препаратов по выдыхаемому воздуху. Для анализа данных используются методы кластерного анализа, сплайн-интерполяции, методы понижения размерности, главной компоненты, проводятся статистические тесты.
6) Разработан и внедрен аппаратно-программный комплекс для мониторинга состава выдыхаемого воздуха у взрослых людей в НЦАГиП им. В.И.Кулакова Минздрава России на основе коммерческого масс-спектрометра фирмы Брукер; оригинального, разработанного в рамках проекта, ионизационного источника; программного обеспечения для анализа масс-спектров, для анализа выдыхаемого воздуха на предмет выявления патологий и проведения фармакокинетических исследований; системы отбора проб выдыхаемого воздуха. Данный комплекс позволит проводить экспресс-мониторинг состояния новорожденных, находящихся на выхаживании в инкубаторах, на основе анализа молекулярного состава выдыхаемого воздуха; развивать методики ионизации образцов выдыхаемого воздуха, как новорожденных, так и взрослых пациентов; создавать базы данных биомаркеров для оценки состояния новорождённых.