Регистрация / Вход
Прислать материал

Перепрограммирование активности микробного комплекса иммунной интерференции путем направленного встраивания в его состав функциональных модулей.

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
crispr/cas супрамолекулярные комплексы барназа барстар лейциновые зипперы белковые модули перепрограммирование функции

Цель проекта:
1) Проект решает задачу перепрограммирования активности микробного комплекса иммунной интерференции Crispr/Cas. 2) Целью проекта является разработка инструментария, позволяющего включать удобным образом в состав интерферирующего комплекса (далее ИК) Crispr/Cas различные белковые функциональные модули, а также получение искусственного интерферирующего комплекса Crispr/Cas системы с измененной функциональностью.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В результате выполнения проекта будут получены рекомбинантные продуценты АТ и белковых компонентов Crispr/Cas системы; изучены и выбраны подходящие пары АТ; сконструированы химерные белковые конструкции ФМ-АТ и ИК-АТ, в которых белковые компоненты ИК и ФМ будут объединены с АТ в составе одной молекулы; определены количественные параметры, характеризующие комплексообразование ФМ-АТ и ИК-АТ; произведено перепрограммирование ИК на выполнение функции регуляции активности репортерного гена люциферазы; изучена функциональная активность перепрограммированного ИК.
2. Рекомбинантные АТ должны образовывать прочные комплексы, имея при этом небольшие размеры. В составе ИК и ФМ должна сохраняться способность к эффективному комплексообразованию АТ. Разработанная методология должна обеспечивать включение разнообразных ФМ в состав ИК. Перепрограммированный ИК должен иметь функциональные характеристики, сравнимые с характеристиками существующих аналогов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. В результате выполнения проекта будет создана методология, позволяющая включать в состав ИК различные белковые функциональные модули (ФМ), а также ИК с измененной функциональностью.
2. Анализ современной научно-технической литературы и патентной документации доказывает инновационность концепции, реализуемой в проекте. Ее востребованность проистекает из того мощного потенциала, который дает Crispr/Cas система. Данный проект нацелен на то, чтобы придать гибкость этому уникальному инструментарию и облегчить работу с ним.
3. В настоящее время задача изменения функциональности ИК решается путем ковалентного присоединения функциональных блоков. Очевидным недостатком такого подхода является отсутствие гибкости. Значительные усилия прикладываются для создания гибридной конструкции способной выполнять только узкоспециализированную задачу. Применение аффинных тагов позволяет реализовать модульный принцип построения Crispr/Cas комплекса, что сильно упрощает задачу изменения его функциональности. Таги будут исполнять роль молекулярных «липучек». Однажды проведенная работа по введению тага в один из белковых компонентов Crispr/Cas системы позволит в дальнейшем присоединять к нему любой из функциональных блоков, снабженных парным тагом.
4. Компоненты системы CRISPR-Cas, а также аффинные таги (АТ), имеют бактериальное происхождение, поэтому представляется целесообразным нарабатывать эти белки в клетках E. coli. В ходе проведения работ крайне важным является структурная и физико-химическая характеристика получаемых препаратов АТ, белков и белковых комплексов ИК и доказательство их подлинности. Для этих целей будут использованы такие методы как денатурирующий гель-электрофорез по Лэмли, гель-фильтрация и масс-спектрометрия. В ходе выполнения проекта предполагается собирать интерферирующие комплексы в активном состоянии из рекомбинантных белков. Поэтому крайне важным является предварительная характеристика белок-белковых взаимодействий прямым способом. Для этого будет использован метод поверхностного плазмонного резонанса. Детальные исследования структурных, физико-химических и биологических особенностей белков будут проведены с использованием комплексного подхода, включающего в себя: методы современной генетической и белковой инженерии, комплекс инструментальных методов, таких как динамическое светорассеяние, высокоэффективная жидкостная хроматография, метод плазмонного резонанса и др.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Методология перепрограммирования функционала Crispr/Cas системы при помощи аффинных тагов, безусловно, найдет самое широкое применение в науке, медицине и биотехнологии. С ее помощью можно будет придать гибкость технологиям, основанным на CRISPR/Cas системе, и облегчить работу с ними. В широком смысле методология применима также к любым другим белковым комплексам для включения в их состав новых функциональных модулей.
2. Практическое внедрение полученных результатов будет достигнуто путем модификации белковых компонентов ИК при помощи АТ. Модифицированные таким образом компоненты ИК будут востребованы при разработке новых технологий, основанных на CRISPR/Cas системе, или же усовершенствовании существующих технологий.
3. Разрабатываемая методология способна существенно упростить разработку и практическое внедрение технологий, основанных на CRISPR/Cas системе. Модульный принцип построения ИК дает возможность формулировать принципиально новые технические решения. Например, к одному и тому же белковому компоненту ИК можно обратимым образом добавлять различные функциональные модули, влияя тем самым на его характеристики. Внедрение результатов проекта способно дать большой экономический эффект за счет сокращения издержек, связанных с перепрограмированием активности ИК. В настоящее время проблема изменения функциональности Crispr/Cas решается за счет ковалентного присоединения к его белковым компонентам различных функциональных блоков белковой природы. Применение аффинных тагов позволяет реализовать модульный принцип построения Crispr/Cas комплекса, что сильно упрощает задачу изменения его функциональности.
4. Сильной стороной проекта является синтез специальных знаний и умения как российских, так и корейских ученых, для выполнения конкретной научно-технической задачи. Корейской стороной будет выполнен весь комплекс молекулярно-биологических и биохимических работ, связанных с системой Crispr/Cas. Российская сторона возмет на себя работы, связанные с дизайном и разработкой белковых пар, которые могли бы быть применены для встраивания в интерферирующий комплекс различных функциональных модулей, а также получение и характеристику химерных белков со встроенными АТ. Поэтому практическая реализация проекта, без всякого сомнения, будет способствовать интенсификации контактов между учеными РФ и республики Корея и заложит основы дальнейшего плодотворного сотрудничества.

Текущие результаты проекта:
К настоящему моменту была создана методологическая база для получения АТ барстар и барназы – собраны плазмидные векторы, направляющие синтез в бактериальных клетках АТ, получены рекомбинантные штаммы, эффективно продуцирующие АТ, подобраны условия выращивания штаммов для максимизации генной экспрессии и разработаны методы выделения и очистки АТ. Кроме того, собраны плазмидные векторы, обеспечивающие эффективный синтез белковых компонентов ИК T. onnurineus: Csm1, Csm2, Csm3, Csm4 и Csm5 в клетках Escherichia coli; получены бактериальные штаммы-продуценты белковых компонентов ИК T. onnurineus, где в качестве штамма-хозяина выступает E. coli RIL (DE3). Оптимизирована экспрессия генов Csm1, Csm2, Csm3, Csm4 и Csm5. Разработаны методы выделения и очистки белковых компонентов ИК: субкомплексов Csm1-Csm4, Csm2-Csm5 и белка Csm3. Белковые компоненты ИК (субкомплексов Csm1-Csm4, Csm2-Csm5 и белок Csm3) были очищены и охарактеризованы физико-химически и функционально. Идентифицированы каталитические субъединицы ИК комплекса. Разработанные штаммы-продуценты АТ позволяют получать не менее 50 мг барназы и 200 мг барстар с литра культуры. Разработанные методики выделения и очистки АТ позволяют получать гомогенные препараты барназы и барстар с выходом не менее 50% в любых необходимых количествах. Разработанные методики получения белковых компонентов ИК позволяют получать миллиграммовые количества этих белков. Достигнутые характеристики рекомбинантных штаммов, синтезирующих белковые АТ и компоненты ИК, а также характеристики методик получения АТ и ИК, являются на уровне, или же превосходят характеристики рекомбинантных штаммов, известных из научно-технической литературы. Созданная на данном этапе методологическая база позволит в дальнейшем проводить белковоинженерные работы любой сложности по перепрограммированию активности микробного комплекса иммунной интерференции. В ходе проведенного патентного исследования по теме проекта не было выявлено патентов, а также научных публикаций, описывающих перепрограммирование активности микробного комплекса иммунной интерференции путем направленного встраивания в его состав функциональных модулей, соединенных с барстаром и/или барназой и/или другими аффинными белковыми тагами. Таким образом, предлагаемый в проекте подход в настоящее время не имеет выявленных близких аналогов в Российской Федерации и за рубежом. Результаты патентного поиска позволяют ожидать выполнение работы в полном объеме, включая подачу заявок и получение новых патентов. Технический уровень существующих изобретений указывает на целесообразность поиска новых технологий для перепрограммирования комплексов иммунной интерференции. Новые соединения, получаемые в ходе работы, являются патентно чистыми объектами.