Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии микроскопической визуализации геномных процессов

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
микроскопия сверхвысокого разрешения, ядро клетки, ген, хромосома, анализ изображений, программное обеспечение

Цель проекта:
Регуляция генов эукариот, привлекающая внимание все большего числа исследователей, тесно связана с архитектурой хромосом, то есть трехмерной организацией хроматина. Известно, что существуют последовательности ДНК, участвующие в регуляции экспрессии генов. В частности, энхансеры отвечают за активацию транскрипции; они могут быть локализованы за несколько т.п.н. выше или ниже регулируемого ими гена. Эта особенность, т.е. способность воздействовать с больших расстояний, натолкнула на два фундаментальных вопроса. Во-первых, как они взаимодействуют с геном-мишенью? Во-вторых, как именно они отличают свою мишень от других генов, расположенных ближе? Ответ на оба вопроса заключен в трехмерной организации хроматина, например, важное значение имеет удаленность регуляторного элемента от гена-мишени. Микроскопия высокого разрешения позволит получить максимальное количество информации о геномных процессах, однако необходимо: 1) разработать технологию визуализации, которая может быть применима для количественного наблюдения за крупными объектами in vivo в течение длительного времени; 2) оптимизировать методы мечения in vivo для визуализации хромосомной динамики и экспрессии генов. Для решения первой задачи требуется совместить прижизненное микроскопирование со сверх-высоким разрешением с количественной оценкой транскрипции путем разработки вычислительной платформы, позволяющей проанализировать информацию, получаемую с изображений образцов. Для оптимизации методов мечения будут использованы различные подходы, в том числе мечение эндогенных энхансеров на основе системы ParB-parS и LacO/LacI. Таким образом, целью проекта является создание новой технологии изучения функционирования генома высших эукариот на основе микроскопии сверх-высокого разрешения. Работа по созданию новой технологии и получению научных результатов рассчитана на 6 лет. В 2015-16 гг планируется провести ключевые эксперименты по подбору характеристик новой технологии и получить первые результаты.

Основные планируемые результаты проекта:
Будет разработана флуоресцентная микроскопия, позволяющая визуализировать процессы в живых тканях с высоким разрешением. Среди существующих технологий, микроскопия светового листа с дискретным освещением является наиболее подходящей для визуализации геномных процессов (быстрое получение изображения больших областей в глубине ткани). Достигаемое разрешение – 370 нм (аксиальное) и 230 нм (латеральное). Так как планируется использовать LLSM в качестве исходной точки исследований по визуализации внутриядерных процессов, для достижения этой цели будет произведен ряд разработок и усовершенствований базового метода LLSM микроскопии, таких как решение проблемы неравномерности интенсивности освещенности поля, которая приводит к неодинаковому уровню свечения в поле зрения, путем внедрения модулятора, меняющего амплитуду свечения в области оптического среза. Кроме того, аберрации, возникающие вследствие уменьшения квантовой чувствительности и качества изображений будут исправлены благодаря оптимизации оптической системы путем подбора среды для заключения к коэффициентом преломления, близким к исследуемым тканям. Кроме того, будут использоваться специфические объективы с большим рабочим расстоянием и подходящими для работы с подобранной для этих целей средой для заключения. Такие объективы будут изготавливаться специально. Для оценки пригодности LLSM микроскопии для количественного анализа в разрабатываемый
микроскоп будет включен модуль двухфотонной визуализации. Полученные при помощи этого модуля изображения будут использоваться для калибровки изображений LLSM микроскопии.
Для количественной оценки геномных процессов будет разработана вычислительная платформа, включающая в себя управление микроскопом, сбор и обработка данных, и их последующий анализ. Программное обеспечение для визуализации и анализа транскрипции было создано ранее и будет интегрировано в разрабатываемую программу.
Использование эмбриона дрозофилы в качестве модели позволит оптимизировать параметры визуализации, в т.ч. найти минимальные расстояния между элементами системы, детектируемые нашими методами. Для этого будут использованы пары энхансер-промотор, разделенные от десятков т.п.н. до находящихся на гомологичных хромосомах (трансвекция). Таким образом удастся определить пределы разрешающей способности метода для его последующего применения в клетках млекопитающих, а также получить новые знания о хромосомных взаимодействиях дальнего действия. Эти исследования также дадут ответы на такие вопросы, как: насколько быстро далеко расположенный энхансер находит промотор гена-мишени и какое количество транскриптов гена производится после этого взаимодействия?

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечный продукт проекта - технология получения и анализа микроскопических изображений клеточных ядер сверхвысокого разрешения. Микроскопия сверх-высокого разрешения будет иметь следующие характеристики:
1) изображение с высоким пространственным разрешением (системы с дифракционным пределом) для визуализации локусов ДНК (в идеале ~1кб); 2) изображение с высокочастотным разрешением для визуализации компонентов динамики хромосом; 3) высококонтрастное изображение для низких погрешностей измерений; 4) наличие взаимосвязи интенсивности измерения с количеством молекул или концентрацией (т.е. оптические измерения должны не зависеть от местоположения в пределах поля зрения) для количественного анализа и моделирования; 5) наблюдение большого количества гомогенных ядер одновременно для статистического анализа значимости; 6) гибкая конструкция для быстрой оптимизации различных экспериментальных параметров, быстрая и воспроизводимая фиксация образцов; 7) вычислительная платформа для эффективного и удобного инструментального контроля и анализа данных высокой пропускной способности.
Микроскопия высокого разрешения живых тканей является сложной задачей. Такие подходы как STED/RESOLFT микроскопия могли бы использоваться в сочетании c микроскопией светового листа, однако наличие лазера с высокой интенсивностью будет способствовать повреждению образцов. Поэтому увеличение разрешение с преодолением барьера Аббе планируется благодаря использованию технологии на основе локализации. Данная технология требует быстрого переключения и наблюдения, так как динамика в живых тканях приводит к «смазыванию» точности местоположения при накоплении снимков в течение длительного времени. Планируется применить микроскопию фотоактивированной локализации с отслеживанием единичной частицы (sptPALM), используя модуль LLSM и развить данную технологию до 3D. Данный подход обеспечит получение снимков со сверх-высоким разрешением, а программное обеспечение позволит обрабатывать результаты и количественно оценивать параметры, например, такие как скорость элонгации, частота и продолжительность взаимодействий регуляторных элементов с промоторами генов и т.д.
Заявленные результаты планируется достичь благодаря интенсивной совместной работе исследователей из Института биологии гена РАН и Института интегративной геномики Льюиса Сиглера при Университете Принстон, США. Имеется необходимое оборудование и получены предварительные результаты. Разрешение полученных снимков удовлетворяет требованиям к исходному разрешению, которого можно достигнуть благодаря технологии в ее текущем состоянии, и которую планируется усовершенствовать. Предварительные результаты по методам мечения регуляторных элементов также показали возможность использования обозначенных систем и подходов, что значительно снижает риски при разработке технологии.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Новая технология позволит совершить прорыв в области изучения функционирования генома высших эукариот. Благодаря технологии секвенирования последнего поколения, исследователи могут прочитать геном любого организма. Однако реализация наследственной информации – экспрессия генов – до сих пор представляет одну из важнейших не до конца изученных проблем молекулярной биологии. Проблема изучения экспрессии генов в режиме реального времени и исследование молекулярных механизмов ее регуляции упирается в недостатки существующих технологий. Наследственная информация, доступная исследователям, представляет собой одномерный статический текст. Однако в живой клетке ДНК, несущая эту информацию, имеет сложную трехмерную упаковку, находящуюся в постоянном движении. Активность гена контролируется путем сближения в ядре регуляторных элементов генома, которые могут быть значительно удалены друг от друга по первичной последовательности. Классический пример такого рода регуляции – сближение энхансера и промотора. В настоящее время активно развиваются постгеномные технологии. Изучение трехмерной структуры ДНК в ядре возможно с помощью метода Chromatin
Conformation Capture (3С). Однако данный метод имеет целый ряд ограничений и не позволяет изучить динамику формирования трехмерной структуры с достаточной точностью. Традиционные методы микроскопического исследования в режиме реального времени также не дают
достаточного разрешения в пространстве. Преодоление существующих ограничений для изучения динамики хроматина в режиме реального возможно с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения, соединенного с компьютерным анализом. Именно на развитие такой технологии
направлен проект. Новый метод визуализации функционирования наследственного аппарата живой клетки позволит изучать ранее недоступные детали этого процесса. Это позволит решить ряд проблем в области фундаментальных исследований регуляции работы генов и создать новую теорию регуляции активности генов. В настоящее время практически полностью отсутствуют данные о связи динамики конформации хроматина в ядре и активностью генов. Новая технология позволит ответить на следующие вопросы: является ли динамика хроматина случайной и экспрессия генов запускается стохастически? Зависит ли активность гена от перемещений хроматина на большие расстояния? Как энхансеры активируют гены в пространстве и во времени в онтогенезе? Регуляция активности генов лежит в основе развития живых организмов и поддержания гомеостаза. Нарушения правильной работы генов приводят к различным нарушениям развития и заболеваниям, в частности, - к раковому перерождению клеток. Таким образом, прогресс в таких областях как молекулярная медицина, генная терапия, клеточная терапия, биотехнология, персонализированная медицина тесно связан с пониманием тонких механизмов, лежащих в основе регуляции активности генов. Понимание этих механизмов откроет возможность их регуляции.
Новая технология будет востребована в области изучения строения и функции генетического аппарата живой клетки. Разработка нового метода визуализации процессов, происходящих внутри ядра живой клетки станет прорывом в молекулярной биологии. Использование новой технологии позволит поднять уровень научных исследований на другой уровень, исследователи смогут изучать процессы, которые ранее могли изучаться лишь опосредовано. Основными потребителями выступят научные центры, проводящие исследования в соответствующей области.
Технические характеристики новой технологии будут описаны в научных публикациях. Работа будет проводится в ведущем мировом научном центре по актуальной тематике современной науки и жизни, что обеспечит непосредственный выход данной технологии на международную арену. Дальнейшее развитие технологии возможно посредством разработки фирмами- производителями микроскопов специальных модулей, а также через создание компаниями наборов молекулярных инструментов для визуализации поведения молекул в клетке.

Текущие результаты проекта:
Проведена визуализация транскрипционной активности в развивающихся эмбрионах дрозофилы с использованием микроскопии светового листа. Время сканирования составляло 1 сек для одного оптического среза размером 20х80х15 мкм в течение длительного времени. Использование данного вида микроскопии не приводило к существенным повреждениям клеток, вызываемых световым облучением, в отличие от других разновидностей микроскопии светового листа. Микроскопия светового листа характеризуется снижением пика мощности света поглощения, что объясняет ее большую биосовместимость. Таким образом, микроскопия светового листа может быть взята за основу для разработки новых методов количественной оценки транскрипции.
Осуществляются эксперименты по мечению эндогенных генов с помощью parB-parS системы, которое позволит получить количественную оценку экспрессии эндогенных генов. При этом прослеживается паттерн транскрипции eve, включающий формирование 7 полос экспрессии и их преобразование в 2 полосы к началу гаструляции. Возможность визуализировать и количественно оценивать эндогенный уровень транскрипции поможет связать полногеномные данные с данными о хромосомной динамике в живых клетках, что является основной целью данного проекта.