Регистрация / Вход
Прислать материал

Повышение толерантности к засолению у продуктивных сортов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L) путем введения транскрипционного фактора OsGATA риса, эктопическая экспрессия которого, индуцируется избыточным засолением

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
пшеница, абиотические стресс, солеустойчивость, транскрипционный фактор osgata, трансформация, северный кавказ, поволжье, оренбуржье, крым

Цель проекта:
Формулировка задачи/проблемы, на решение которой направлен реализуемый проект: Создание новых сортов сельскохозяйственных растений с использованием постгеномных и биотехнологических методов является наиболее приоритетным направлением программы развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года. Сорта и гибриды нового поколения, устойчивые к засолению, засухе, болезням, гербицидам, насекомым-вредителям представляют чрезвычайный интерес для современного растениеводства. Например, использование солеустойчивых сортов ценных культур позволит вовлекать в сельскохозяйственный оборот засоленные земли, которые в РФ занимают площадь 16,3 млн. га, что составляет 9% от общей площади с/х земель. Пшеница является стратегическим продуктом для России и всего мира. В настоящее время, пшеница обеспечивает 21% всех пищевых калорий в мире. Потери урожая данной культуры в различных экологических и метеорологических условиях, возникают из-за засухи, засоленности, морозов, жары, грибных и вирусных болезней и насекомых. Каждый из перечисленных факторов среды может снижать урожайность, в среднем, на 15%. Получение устойчивых к засолению сортов пшеницы, позволит значительно повысить рентабельность данной культуры для РФ. Формулировка цели реализуемого проекта: Повышение толерантности к засолению у продуктивных сортов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) путем введения транскрипционного фактора OsGATA риса, эктопическая экспрессия которого, инициируется избыточным засолением.

Основные планируемые результаты проекта:
Краткое описание основных результатов (основные практические и экспериментальные результаты, фактические данные, обнаруженные взаимосвязи и закономерности):
1 Промежуточный и заключительный отчеты о НИР, содержащие:
1.1 Обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках НИР;
1.2 План исследований по созданию продуктивных сортов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), толерантных к засолению;
1.3 Результаты экспериментальных исследований по повышению толерантности к засолению у продуктивных сортов мягкой пшеницы, путем введения транскрипционного фактора OsGATA;
1.4 Рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках;
1.5 Обобщение и выводы по результатам НИР.
2 Отчет о патентных исследованиях.
3 Коллекция растений исходных сортов яровой мягкой пшеницы, пригодных для трансформации.
4 Коллекция трансгенных линий пшеницы (Т1) и (Т2), экспрессирующих ген OsGATA.
5 Две публикации по результатам проекта в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (WEB of Science).
6 Заявка на патент, полученная по результатам проекта.
7 Результаты, которые будут получены иностранным партнером:
7.1 Аннотационный отчет, содержащий протоколы амплификации полноразмерной копии гена транскрипционного фактора OsGATA из риса и создания вектора для агробактериальной и биобаллистической генетической трансформации пшеницы, несущий ген транскрипционного фактора OsGATA.
7.2 Экспериментальный образец полноразмерной копии гена транскрипционного фактор OsGATA из риса, повышающего толерантность к засолению.
7.3 Экспериментальный образец вектора для агробактериальной и биобаллистической генетической трансформации пшеницы, несущий ген транскрипционного фактора OsGATA
7.4 Аннотационный отчет, содержащий:
7.4.1 Результаты оценки продуктивности и степени стабильности признаков запасных белков глиадинов, ответственных за хлебопекарные качества пшеницы у отобранных трансгенных линий пшеницы, толерантных к засолению;
7.4.2 Результаты оценки толерантности трансгенных линий (T2) к засолению и функциональной роли транскрипционного фактора OsGATA в регулировании устойчивости пшеницы к стрессу, вызываемому засолением.
Основные характеристики планируемых результатов (в целом и/или отдельных элементов), научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1 Коллекция исходных сортов должны быть представлена здоровыми растениями, выращенными в условиях теплицы при фотопериоде 16/8 часов, температурном режиме 25°/15°С (день/ночь) и умеренном поливе.
2 Полноразмерная копия гена osgata должна содержать не менее 219 п.н, кодирующих транскрипционный фактор OsGATA.
3 Вектор для агробактериальной и биобаллистической генетической трансформации пшеницы, должен содержать Т-ДНК область, несущую ген gus под 35S промотером, ген hygR под усиленным 35S промотером и ген osgata под злакоспецифическим промотором.
4 Для трансформации используют морфогенные каллусы пшеницы, полученные из незрелых зародышей.
5 Для агробактериальной трансформации вектор pCAMBIA1304-OSGATA должен быть трансформирован в супервирулентнную линию Agrobacterium tumefaciens.
6 Биобаллистическая трансформация должна проводиться с использованием “генной пушки” PIG (Particle inflow gun), при следующих условиях: давление гелия при выстреле - 6 атм.; расстояние от ткани мишени (каллус) до источника частиц (фильтродержателя) - 12 см, объем газа при выстреле - 6 см3; сечение ячейки рассекающего фильтра - 500 мкм; отрицательное давление вакуума в камере при выстреле - 30 мм ртутного столба.
7 Трансформированные клетки должны отбираться на питательной среде с селективным агентом гигромицином (hyg) в концентрации не менее 15 мг/л.
8 Наличие трансгенной вставки должно быть подтверждено с использованием методов ПЦР на фрагменты Т-ДНК, а также с использованием GUS-окрашивающего раствора X–Gluc.
9 Экспрессия гена транскрипционного фактора OsGATA в трансгенных растениях должна быть подтверждена ИФА анализом.
10 Трансгенные линии поколения Т2 должны быть получены от трансгенных линий Т1, экспрессирующих транскрипционный фактор OsGATA.
11 Толерантность трансгенных линий Т2 к засолению должна быть подтверждена физиологическими и биохимическими анализами по стандартным протоколам.


Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Описание конечного продукта, создаваемого с использованием результатов, планируемых при выполнении проекта, места и роли проекта и его результатов в решении задачи/проблемы:
1. Экспериментальный образец полноразмерной копии гена транскрипционного фактор OsGATA из риса, повышающего толерантность к засолению, может быть использован для клонирования в различные векторные конструкции. Данные конструкции могут быть использованы для генетической трансформации других видов растений.
2. Экспериментальный образец вектора pCAMBIA1304-OsGATA для агробактериальной и биобаллистической генетической трансформации, несущий ген транскрипционного фактора OsGATA, может быть использован для получения трансгенных линий различных сортов пшеницы (в том числе и озимой), а также других злаковых культур (ячмень, овес, кукуруза).
3. Полученные трансгенные растения пшеницы, несущие ген OsGATA, могут быть использованы для дальнейшего изучения функциональной роли транскрипционного фактора OsGATA в регулировании устойчивости растений к стрессу, вызываемому другими абиотическими факторами (засуха).
4. Созданные в ходе НИР трансгенные линии пшеницы, толерантные к засолению, могут быть использованы при создании солеустойчивых сортов для выращивания в Северо-Кавказском регионе, Оренбуржье, Поволжье и Крыму, где значительная часть земель засолена.

Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик:
В настоящее время модификация регуляторных генов высших организмов является передовой областью зелёной битехнологии. Для получения живых клеток с направленно модифицированным геном применяют целый ряд выскотехнологичеких подходов: методы молекулярного клонирования, методы биобаллистики и агробактериальной трансформации и т.д. С целью объективного контроля наследования нужного признака, используют широкий спектр таких методов как иммуноферментный анализ, полимеразно-цепная реакция и т.п. Применение перечисленных инструментов позволяет прогнозировать получение инновационных результатов в области биотехнологии растений.

Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень:
Полученные результаты находятся на конкурентном уровне относительно аналогичных исследований иностранных учёных. Использование регуляторных генов высших растений позволит создать сорта с новыми хозяйственно-ценными признаками. Данный подход активно разрабатывается ведущими в этой области странами как США, ЕС и Канада.

Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски:
Предложенный в настоящем проекте научный и экспериментальный план достижения заявленных результатов является оптимальным и достижимым. Основным риском является нарушение сроков финансирования проекта и сроков поставок реактивов для проведения работ.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция):
Основными областями науки и техники, в которой могут быть актуальны планируемые результаты ПНИ, являются сельское хозяйство и агробиотехнология. К отраслям промышленности и социальной сферы, в которых могут они использоваться или планируемая на их основе инновационная продукция, могут быть отнесены такие научно-исследовательские институты как ГБУ РК "Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма", ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства им. П.П.Лукьяненко (Краснодар), ГНУ Ставропольский НИИСХ (Ставрополь), ВНИИ зерновых культур имени И.Г. Калиненко (Зерноград, Ростовская область), ГНУ НИИСХ Юго-Востока (Саратов), ФГБНУ "Московский НИИСХ «Немчиновка» (Московская обл.) и др.

Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования:
Практическое внедрение планируемых результатов будет включать получение охранных документов на изобретения, публикации основных результатов НИР в высокорейтинговых журналах, участие во Всероссийских и Международных мероприятиях (семинары, конференции, выставки и т.д.) для освещения и популяризации промежуточных и окончательных результатов НИР. Результаты НИР могут быть использованы в селекционных программах при создании новых сортов и гибридов злаковых культур, устойчивых к засолению. Полученные трансгенные линии пшеницы, толерантные к засолению, могут быть использованы при создании солеустойчивых сортов для выращивания в Северо-Кавказском регионе, Оренбуржье, Поволжье и Крыму, где значительная часть земель засолена.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы:
Настоящая работа относится к области «зелёной» биотехнологии, методы которой за последние 20 лет стали широко применяться в сельском хозяйстве. Российская Федерация существенно отстаёт в этом направлении от ведущих стран. Отставание столь значительное, что, по оценкам ISAAA, только через 10 лет интенсивного развития агробиотехнологии, в России смогут быть сформированы серьезные предпосылки для того, чтобы в последующие годы оказывать конкуренцию лидирующим в этой отрасли странам, а российские разработки соответствовать мировому уровню и занять свое место на рынке биотехнологических культур.
По оценкам экспертов Общества биотехнологов России им Ю.А. Овчинникова и Союза предприятий биотехнологической отрасли широкое использование биотехнологий в сельском хозяйстве РФ позволит решать следующие проблемы и добиться следующих результатов:
1. увеличить производительность в отрасли (в том числе за счёт использования непригодных для с/х земель);
2. получить растения с улучшенными качественными характеристиками и устойчивые к абиотическим и биотическим стрессам;
3. уменьшить использование пестицидов и гербицидов (экологические и экономические выгоды);
4. сократить выброс углекислого газа (сокращение выброса благодаря биотехнологическим с/х культурам в 2007 году, по данным ISAAA, составило 14.2 млрд. кг СО2);
5. сохранить и увеличить биоразнообразие (в том числе путем использования засоленных сельскохозяйственных земель);
6. предотвратить эрозию почв (за счет перехода на метод обработки почвы, не требующий вспахивания).
Прогнозируется, что подобная модернизация сельского хозяйства должна дать положительный социально-экономический эффект, который будет заключаться как в улучшении уровня благосостояния работников сельскохозяйственного направления и улучшении здоровья потребителей за счет снижения содержания в потребляемых продуктах пестицидов, инсектицидов и прочих вредных химикатов, так и в снижении загрязнённости воды, воздуха и почвы.

Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры
Влияние планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры будет происходить путем проведения круглого стола совместно с иностранным партнером, с привлечением ученых, экспертов и специалистов в данной области, публикации результатов НИР в ведущих научных изданиях.
Иностранный партнер обладает современной инфраструктурой, главной целью которой является формирование достаточных условий для обеспечения полноценного процесса создания конкурентоспособной наукоёмкой и высокотехнологичной научно-технической продукции посредством предоставления современных научно-производственных площадей и доступа к исследовательскому оборудованию и новейшим технологиям в области генетической инженерии растений.

Текущие результаты проекта:
Согласно календарному плану, за отчетный период были получены следующие промежуточные результаты:
1. Проведен тщательный анализ научно-технической литературы (статьи, патенты, монографии) и на основе проведенного анализа, разработаны экспериментальные и методические подходы, а также составлен план исследований для решения поставленных задач НИР.
2. Проведено патентное исследование в соответствии ГОСТ Р 15.011-96, показавшее перспективность разрабатываемых технологий. Заканчивается оформление отчета о патентном исследовании.
3. Посажена коллекция исходных сортов яровой мягкой пшеницы. Растения выращиваются в условиях теплицы при фотопериоде 16/8 часов, температурном режиме 25°/15°С (день/ночь) и умеренном поливе. Проводиться регулярная фитосанитарная обработка культивируемых растений.
4. Иностранным партнером подготовлен аннотационный отчет, содержащий протоколы амплификации полноразмерной копии гена транскрипционного фактора OsGATA из риса и создания вектора для агробактериальной и биобаллистической генетической трансформации пшеницы, несущий ген транскрипционного фактора OsGATA.