Регистрация / Вход
Прислать материал

Биоэкономичный синтез лигнанов

Номер контракта: 14.616.21.0001

Руководитель: Головлева Людмила Алексеевна

Должность: Зав. лабораторией

Организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пущинский научный центр Российской академии наук
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина Российской академии наук

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
лигнаны, монолигнолы, белки-диригенты, лакказы, гетерологическая экспрессия, метаболическая инженерия, связь структуры и функции, химический синтез, биосинтез

Цель проекта:
Целью проекта является разработка высокоэффективного нового способа направленного биосинтеза природных и неприродных лигнанов с помощью бактериальной системы экспрессии (на основе E. coli). Для реализации поставленной цели предполагается решение следующих основных задач: 1) Поиск и гетерологическая экспрессия в клетках E. coli алкалофильных лакказ, специфичных к природным и неприродным монолигнолам; 2) Гетерологическая экспрессия в клетках E. coli белков-диригентов в качестве инструмента для регио- и стереоселективной полимеризации природных и неприродных монолигнолов; 3) Химический синтез природных и неприродных монолигнолов для последующего бактериального синтеза лигнанов и сравнительного анализа, предварительный биосинтез природных и неприродных лигнанов in vitro посредством отобранных лакказ и белков-диригентов; 4) Метаболическая инженерия бактериальной продукции лигнанов и их аналогов.

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе проекта планируется получение следующих результатов:
1. Будет разработан быстрый метод определения алкалофильной лакказной активности микроорганизмов, с помощью которого из коллекций ЛЕДОС и ВКМ ИБФМ РАН будут отобраны грибные и бактериальные штаммы-продуценты алкалофильных лакказ и оптимизированы их условия культивирования с целью повышения лакказной продукции (Российский партнер).
2. С помощью химического синтеза будут получены в необходимом количестве природные и неприродные аминокислоты, монолигнолы и лигнаны для последующего использования в кинетических исследованиях лакказ и белков-диригентов, а также в качестве референсных соединений в последующих исследованиях свойств созданных бактериальных платформ (Немецкий партнер).
3. Из наиболее перспективных грибных и бактериальных штаммов будут выделены лакказы, специфичные к природным и неприродным монолигнолам, и охарактеризованы их физико-химические, кинетические и структурные свойства. С помощью методов рентгено-структурного анализа и молекулярного моделирования будут выявлены структурные детерминанты лакказ, определяющих их алкалофильность и специфичность к природным и неприродным монолигнолам (Российский партнер).
4. Будут получены посредством гетерологической экспрессии варианты штамма E. coli, продуцирующие наиболее активные грибные и бактериальные лакказы, а также созданы методами направленной эволюции и сайт-направленного мутагенеза мутантные формы алкалофильных лакказ, высокоспецифичные к природным и неприродным монолигнолам (Российский партнер в сотрудничестве с Немецким партнером).
5. Будет оптимизирована система гетерологической экспрессии в E. coli. и дрожжах (Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae) растительных белков-диригентов atDir6 и fiDir1 в растворимой форме, охарактеризованы их кинетические и структурные свойства, а также механизмы катализа димеризации природных и неприродных лигнолов в присутствии отобранных в ходе проекта лакказ. Будут подобраны наиболее активные комплексы ферментов (лакказы-белки-диригенты) с целью получения природных и неприродных лигнанов (Немецкий партнер в сотрудничестве с Российским партнером).
6. Будет создана бактериальная платформа на основе E. coli для продукции p-кумарового спирта путем введения в уже разработанный ранее Немецким партнером путь трансформации L-тирозина дополнительных ферментов (циннамоил-СоА редуктазы (ЦСР) и циннамил-алкогольдегидрогеназы (ЦАД)), с последующей адаптацией платформы (специфичности ферментов) к синтезу природных и неприродных монолигнолов (Немецкий партнер).
7. Полученная бактериальная платформа синтеза монолигнолов на основе E. coli будет расширена путем добавления лакказ и белков-диригентов и адаптирована для получения широкого спектра природных и неприродных лигнанов (Немецкий партнер в сотрудничестве с Российским партнером).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В ходе настоящего проекта будет создан принципиально новый и высокоэффективный способ биологического синтеза ценных природных и неприродных лигнанов на основе E. coli, обладающий рядом преимуществ перед традиционными способами получения лигнанов (химическим синтезом и экстракцией растительного материала): а) быстротой и легкостью получения (высокие титры конечного продукта, отсутствие высоких концентраций примесей, легкость разрушения бактериальных клеток); б) экологической безопасностью (неиспользование токсичных соединений, отсутствие вредных продуктов, водная среда); в) минимальными затратами (не требует дорогих катализаторов, повышенных энергозатрат (температуры, давления), синтез основан на модификации первичных клеточных метаболитов) и г) возможностью направленного и контролируемого получения широкого спектра лигнанов с новыми свойствами.
Полученные в проекте данные откроют перспективные возможности создания совершенно новых потенциально востребованных фармакологических препаратов, расширят горизонты биотехнологического применения лакказ и белков-диригентов, позволят заложить фундаментальные знания о структуре и функции ферментов в целом.
Кроме того, в ходе проекта будут параллельно созданы бактериальные платформы для синтеза не менее ценных природных и неприродных монолигнолов.
Полученные в проекте данные откроют перспективные возможности создания совершенно новых потенциально востребованных фармакологических препаратов, расширят горизонты биотехнологического применения лакказ и белков-диригентов, позволят заложить фундаментальные знания о структуре и функции ферментов в целом.


Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Предложенная в результате проекта бактериально-клеточная технология синтеза ценных лигнанов может получить широкое применение в фармакологической промышленности для синтеза биологически активных соединений с канцеролитическими, цитостатическими, антиоксидантными, антибактериальными, фунгицидными, антипаразитарными, стимулирующими и адаптогенными свойствами.
Монолигнолы могут также быть использованы и для других биотехнолгических целей (синтез полимеров, адгезивных соединений и пр.), а также в качестве стандартов для различных видов анализа.
Продолжением настоящего проекта станет детальное исследование биологических эффектов получаемых с помощью разработанной платформы неприродных лигнанов.
Разработанные бактериальные платформы биосинтеза монолигнолов и лигнанов, как и сами продукты биосинтеза будут предложены фармацевтическим компаниям (Novo Nordisk, Novozymes, Bayer, X-zymes, Boehringer Ingelheim, Novartis) и другим компаниям по продаже химических соединений (Sigma-Aldrich, Merck).


Текущие результаты проекта:
В ходе работ по проекту в 2015 г. получены следующие результаты:

1. Разработан быстрый метод определения алкалофильной лакказной активности микроорганизмов посредством хромогенной реакции. Метод позволяет использовать минимальные объемы тестируемых биологических жидкостей (30 мкл), что значительно сокращает объемы культивационных работ, дает возможность быстрого проведения скрининга большого количества штаммов во времени, и в течение короткого времени и в минимальном объеме позволяет оценить рН-оптимум продуцируемых грибами оксидаз в реакциях с индикаторными субстратами. Описанный подход может применяться для количественного анализа хромогенной реакции с использованием планшетного спектрофотометра.
2. Осуществлен скрининг грибных и бактериальных штаммов из коллекций микроорганизмов ЛЕДОС и ВКМ ИБФМ РАН, продуцирующих алкалофильную лакказную активность. Отобрано 5 штаммов-продуцентов алкалофильных оксидаз (2 аскомицета, 1 дейтеромицет, 1 базидиомицет и 1 актиномицет). Кроме того, найдены еще 1 базидиальный штамм, продуцирующий лакказы, достаточно активные в нейтрально-щелочных условиях, и 3 актиномицета с лакказной активностью, близкой к нейтральной области рН, имеющих определенный потенциал для использования в целях проекта.
3. Проведен скрининг отобранных грибных и бактериальных штаммов на предмет лакказной активности с природными и неприродными монолигнолами. Большинство отобранных штаммов способны продуцировать алкалофильные оксидазы, окисляющие фенилпропаноиды (в том числе монолигнолы) при рН7.2 с разной субстратной избирательностью.
4. Оптимизированы условия культивирования отобранных грибных и бактериальных штаммов с целью повышения выхода алкалофильной лакказной активности с природными и неприродными монолигнолами для последующей очистки исследуемых ферментов.
5. В настоящий момент осуществляется разработка способов очистки алкалофильных оксидаз, проводится их характеристика (физико-химические, кинетические свойства), исследуются продукты реакции окисления фенилпропаноидов, катализируемой оксидазами.