Регистрация / Вход
Прислать материал

Новые экспрессионные системы для высокопродуктивной гетерологичной экспрессии бактериальных экзо-ферментов, востребованных промышленной биотехнологией

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
экспрессия целлюлаз, термофильные целлюлазы, ферментативный гидролиз

Цель проекта:
Клостридиальные целлюлазы являются компонентами целлюлосомы термофильной бактерии Clostridium thermocellum и являются наиболее активными ферментами из известных целлюлаз при гидролизе микрокристаллической целлюлозы. Реконструкция активной целлюлосомы in vitro требует высокоэффективной экспрессии основных целлюлолитических ферментов. Ранее была осуществлена попытка экспрессии отдельных целлюлаз в системе грамотрицательных бактерий E.coli и метанол-утилизирующих дрожжей Pichia pastoris. Однако, в первом случае уровень экспрессии был слишком низок, а во втором- получаемый фермент был неактивен. Поэтому, целью предлагаемых научных исследований является получение детектируемого уровня экспрессии целевых бактериальных целлюлаз бактерий Clostridium thermocellum в эукариотических системах экспрессии низших грибов двух родов - Penicillium и Aspergillus (для российской научной группы), а также системе экспрессии бактерий рода Bacillus (для иностранного партнера- Технического Университета Мюнхена).

Основные планируемые результаты проекта:
В ходе выполнения научных исследований должны быть получены следующие научно-технические результаты:
-) Должен быть проведен аналитический поиск современной научно-технической, нормативной, методической литературы, относящейся к теме экспрессии гетерологичных генов в эукариотических системах. А также осуществлены теоретические исследования в области существующих способов получения рекомбинантных штаммов промышленного значения. Проведен анализ потребностей рынка ферментных препаратов целлюлаз и исследования структуры экспрессионных векторов, используемых при трансформации грибов рода Penicillium и Aspergillus. Сделан выбор оптимальных регуляторных элементов векторов.
-) Проведены экспериментальные исследования, а именно, сконструированы экспрессионные вектора в целях получения рекомбинантных грибных штаммов-продуцентов термофильных бактериальных целлюлаз, получены рекомбинантные грибные штаммы, секретирующие целевые целлюлазы, проведены эксперименты по культивированию новых штаммов в оптимизированных ферментационных средах, получены и стабилизированы жидкие и сухие формы ферментных препаратов бактериальных целлюлаз, описаны их биохимические и физико-химические свойства.
-) Проведена Технико-экономическая оценка результатов исследований, сделаны обобщения и выводы, а также выданы рекомендации и предложения по использованию результатов научных исследований.
-) Получены экспериментальные образцы, включая синтетические ДНК, кодирующие бактериальные целлюлазы; жидкие и сухие формы ферментных препаратов, полученных на основе новых рекомбинантных штаммов; лабораторные методики трансформации реципиентных грибных штаммов, лабораторный регламент получения ферментных препаратов бактериальных целлюлаз в эукариотических системах экспрессии.
Основные характеристики планируемых результатов заключаются в том, что : 1) продуктивность штаммов-продуцентов ферментных препаратов карбогидраз по белку должна составлять не менее 10 граммов на 1 литр культуральной среды, секретируемой грибными штаммами; 2) содержание карбогидраз , в т.ч. целлюлаз доложно быть не менее 80% от общего секретируемого белка; 3) время культивирования рекомбинантных штаммов не должно превышать 160 часов для штаммов-продуцентов на основе Penicillium; 4) время культивирования не должно превышать 210 часов для штаммов-продуцентов на основе Aspergillus; 5) ферментные препараты бактериальных целлюлаз должны обладать следующими ферментативными активностями: для CelL по PASC 400 мЕд/мг, не менее; по Avicel - 10 мЕд/мг, не менее; для CelТ по PASC 300 мЕд/мг, не менее; по Avicel - 80 мЕд/мг, не менее.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Конечным продуктом выполняемой разработки являются экспериментальные образцы рекомбинантных штаммов-продуцентов бактериальных целлюлаз, которые должны быть получены путем трансформации генетическими конструкциями, несущими гены целлюлаз из бактерии Clostridium thermocellum, а также стабильные формы ферментных препаратов, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов по оптимизированным схемам ведения ферментационнных процессов с определением необходимых производственных параметров.
Результаты, получаемые в процессе разработки, являются абсолютно новыми, способными к опубликованию и патентованию. При проведении патентных исследований и анализа научно-технической литературы аналогичных работ не обнаружено. С этим также связаны ограничения и риски проводимых работ. Однако, научно-технический задел авторского коллектива в области разработки, получения и внедрения ферментных препаратов промышленного значения на основе реципиентных штаммов рода Penicillium, позволяет предполагать снижение рисков неисполнения обязательств по проекту до минимума.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Результаты, полученные на втором этапе проекта, могут быть использованы для дальнейшей реконструкции бактериальной целлюлосомы in vitro, что, в свою очередь, позволит моделировать высокоэффективные ферментативные системы для деградации целлюлозосодержащих материалов. Такие системы могут быть более эффективны (уменьшение дозировки ферментного препарата, увеличение скорости ферментативного гидролиза) по сравнению с существующими ферментными препаратами, основой которых являются целлюлазы грибного происхождения.
Полученные научные результаты могут лечь в основу разработки эффективной и экологически безопасной технологии ферментативной переработки растительных целлюлозосодержащих субстратов в технические сахара, которые являются основным субстратом для микробного синтеза таких востребованных продуктов как органические кислоты и растворители. Переход на эффективные ферментативные технологии позволит снизить экологическую нагрузку на окружающую среду, что является жизненно важным фактором при использовании имеющихся и планировании будущих производств.

Текущие результаты проекта:
Основным результатом по итогам первого и второго этапов выполнения совместного проекта является получение рекомбинантных штаммов гриба Penicillium canescens c детектируемым уровнем экспрессии бактериальных целлюлаз CELS и CELR. Уровень гетерологичной экспрессии составляет 15-20% для белка CELS и 10-15% для белка CELR от общего пула секретируемых ферментов. При этом был проведен следующий набор экспериментальных работ: 1) клонированы синтезированные гены celS, celR, celL и celT в интеграционные вектора для экспрессии в штамме Penicillium canescens и Aspergillus awamori, 2) созданы конструкции pGA-CELR, pGA-CELS, pCELL и pGA-CELT для экспрессии в реципиентном штамме Aspergillus awamori и pXyl-CELR, pXyl-CELS, pXyl-CELL, pXyl-CELT, pXyl-CELR-His и pXyl-CELS-His для экспрессии в реципиентном штамме Penicillium canescens RN3-11-7, 3) экспрессионные конструкции были трансформированы в соответствующие реципиентные штаммы, 4) первичный скрининг трансформантов показал наличие вставки гетерологичных генов celL, celS, celR и сelT в хромосомы реципиентных грибов Asp.awamori и Pen.canescens, 5) тестирование секреции клостридиальных целлюлаз в грибных штаммах показало наличие гетерологичной полосы у рекомбинантных штаммов-продуцентов белков CELS и CELR, 6) анализ данных MALDI-TOF масс-спектрометрии доказал наличие искомых клостридиальных целлюлаз при экспрессии в штамме Pen.canescens как в случае CELS, так и в случае CELR, 7) сопоставление данных электрофореза и данных по определению эндоглюканазной активности позволило отобрать шесть рекомбинантных штаммов, а именно: Penicillium canescens CS-6 , CS-15, CSH-19, CSH-26, CRH-2, CRH-11.

В течение третьего этапа, к середине ноября 2015 г., были получены следующие результаты :
1. Проводится изучение стабильности продукции клостридиальных целлюлаз рекомбинантными штаммами рода Penicillium. Показано, что штаммы-продуценты сохраняют способность к секреции целевых белков после серии из четырех последовательных пересевов.
2. Проведено культивирование отобранных рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium и Aspergillus в 1-л ферментерах на стандартной среде культивирования. Показано, что в стандартной среде культивирования для рекомбинантных штаммов рода Penicillium белок CELR и CELS деградирует и имеет молекулярную массу 72 кДа и 74 кДа, соответственно по данным электрофореза в денатурирующих условиях. В стандартной среде культивирования штамма Aspergillus awamori белки CELR и СELS не деградируют, однако, уровень экспрессии в культуральной жидкости данного штамма низок и может быть детектируем только с применением Western Blot анализа. Такой же (примерно 0,5-1% от общего пула секретируемых белков) уровень экспрессии наблюдался и для рекомбинантных штаммов- продуцентов CELL и CELT.
3. Для решения проблем, описанных в п.2 был оптимизирован состав культуральной среды рекомбинантных штаммов рода Penicillium. Показано, что повышение концентрации хлорида кальция в стартовой среде приводит к стабилизации клостридиальных целлюлаз во время культивирования рекомбинантных штаммов Penicillium CS15 и CRH11.
4. Рекомбинантные штаммы Penicillium сanescnes CS-15 и CRH-11 депонированы во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов.
5. Готовится заявка на патент "Ферментный препарат бактериальной целлюлазы CELS и способ его получения", которая будет подана до конца 3-его этапа.
6. Опубликована статья: Dotsenko AS, Gusakov AV, Volkov PV, Rozhkova AM, Sinitsyn AP "N-Linked Glycosylat ion of RecombinantCellobiohydrolase I (Cel7A) From Penicillium verruculosum and Its Effect on the Enzyme Activity" в журнале "Biotechnology and Bioengineering" (IF=4,126), doi:10.1002/bit.25812.
7. Принято участие в 2-х международных конференциях: 1) 10-ая международная конференция "Биокатализ-2015" (Истра, Моск область, 21-26.06.2015) и 2) IX Международная научная конференция "Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты" (Минск, Белоруссия, 7-11.09.2015), где были доложены результаты проекта.
8. Проведен совместный семинар с немецкими коллегами, где были обсуждены текущие результаты проекта и способы решения создавшихся проблем как с российской, так и с немецкой стороны. Также было пройдено обучение по использованию зарубежной инфраструктуры (5-9.10.2015, Мюнхен, Технический Университет). В качестве единицы оборудования была использована роботизированная установка Tecan Fluent, позволяющая проводить эксперименты по технологии high-throughput, используемой, например, при скрининге рекомбинантных штаммов.