Регистрация / Вход
Прислать материал

Сочетание синхротронных излучателей с лазерами на свободных электронах для структурно-функционального изучения объектов молекулярной медицины как пример создания принципиально новых междисциплинарных синергий.

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
рентгено-структурный анализ, белковые комплексы, адаптивный и врожденный иммунитет, антитела, презентация антигена, аутоиммунные заболевания, опухолевая трансформация метастазирование, клеточная адгезия, селектины, фемтосекундная кристаллография, лазеры на свободных электронах, синхротрон

Цель проекта:
Совместное использование существующих и перспективных рентгеновских источников в Гамбурге для применения в биомедицинских и клинических исследованиях при эквивалентном участии ведущих исследовательских групп из России и Германии. Первоочередной задачей проекта является создание, совершенствование и объединение аппаратного и программного обеспечения, непосредственно связанных с синхротронной и FEL инфраструктурами, которые, в свою очередь, будут активно использоваться в проекте. Второй и третьей задачами будет вплетение биомедицинских проектов высокой значимости в разработанные технологические платформы.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Создание суб-библиотек активных центров каталитических антител A17 и/или A5; составление отчет о проведении молекулярного моделирования, MD, QM расчетов для построения 3D моделей функционально активных антител и предсказания создания мутантных форм биокатализатора с улучшенными свойствами; получение генетических конструкций, содержащих открытую рамку считывания селектинов и Fra-2, а также нетранслируемые усилители синтеза белка и создание лабораторной методики экспрессии селектинов и Fra-2. Получение оригинальных векторов для высокоэффективной экспрессии функционально активных каталитических антител и создание лабораторной методика экспрессии рекомбинантных каталитических антител, лабораторной методики скрининга библиотек каталитических антител методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/вода. Наработка экспериментальных партий препаратов рекомбинантных белков, пригодных для кристаллизации.
Получение результатов рентгено-структурного анализа рекомбинантных белков и создание отработанного протокола сбора данных с криогенно-фиксированной суспензии кристаллитов методом поточной кристаллографии на синхротроне; создание методики исследования биологических образцов методом совместного анализа синхротронным излучателем и лазером на свободных электронах, протоколы обработки данных совместного анализа синхротронным излучателями и лазером на свободных электронах и протокол отбора преципитатов биологических образцов методом совместного анализа синхротронным излучателями и лазером на свободных электронах и методики анализа кинетики взаимодействия рекомбинантных белков семейства иммуноглобулинов с лигандами методом фемта-секундной кристаллографии.
Создание «ноу-хау», оформленных по результатам данного исследования.
2). Отработанный протокол сбора данных с криогенно-фиксированной суспензии кристаллитов в нейлоновой петлей должен осуществляться не более чем за час работы синхротронного луча; поток пучка электронов на лучевой линии P14 должен достигать 1013 фотонов в секунду в поперечном сечении до ~1 мкм2; получаемые в ходе исследований генетические конструкции должны обеспечивать синтез функционально активных рекомбинантных антител, селектинов и Fra-2 с выходом уровнем экспрессии не менее 10 мг/л; создаваемые библиотеки активных центров биокатализаторов должны иметь представительность не менее 10 E4 вариантов; в процессе скрининга библиотеки должно быть отобрано не менее 20 вариантов для дальнейшего энзимологического и физико-химического исследования; лабораторные методики наработки, выделения и очистки рекомбинантных каталитических антител, селектинов и Fra-2 должны обеспечить получение не менее 20 мг белкового препарата с чистотой не менее 95%, пригодного для кристаллизации.





Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
В результате предлагаемого проекта мы ожидаем определить пространственные структуры функциональных белковых комплексов врожденного и адаптивного иммунного ответа (1) структуру высокого разрешения селектинов человека и мыши в комплексе с углеводными остатками сиалил-Льюис X и А, (2) структуру высокого разрешения ряда антител, потенциальных «каталитических вакцин», конвертирующих фосфорорганические токсины, а также (3) структуру ГКС II, взаимодействующего с пептидными фрагментами МВР.
В процессе выполнения проекта уже получены библиотеки биокатализаторов, отработаны методы их высокопроизводительного скрининга и на основании данных структурного анализа будут предложены механизмы деградации фосфорорганических соединений, что внесет вклад в фундаментальные знания энзимологии каталитических антител. Будет опробован и валидирован алгоритм предсказания функционально-значимых аминокислотных замен с применением QMMM и MD расчетов.
Основная роль в осуществлении биохимических процессов отводится белкам – их межмолекулярному взаимодействию друг с другом или их реакциям с низкомолекулярными лигандами (субстратами, ингибиторами, кофакторами). Изучение особенностей трехмерной, пространственной организации белков позволит выявить взаимосвязи с их функционированием в рамках осуществления конкретных процессов. На сегодняшний день существует множество физико-химических методов для определения пространственной структуры макромолекул: традиционно основным является рентгеноструктурный анализ (РСА), позволяющий получить пространственные модели, в которых точно указано положение каждого атома, также широко используются методы малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (КЭМ). На сегодняшний день поток биологической информации неуклонно нарастает, что свидетельствует о новом направлении развития биологии в постгеномную эпоху, целью которого является определение пространственного строения максимального числа «ключевых» белков. Статистика пополнения PDB (Protein Data Bank (www.rcsb.org) банка за последние 20 лет демонстрирует значительный рост числа структур.
Принципиально новые возможности как для структурного анализа биологических объектов, так и изучения их функциональной структурной динамики открывает фемтосекундная кристаллография .Для ее реализации наиболее перспективными из всех известных источников рентгеновского излучения являются лазеры на свободных электронах (FELs). Самый мощный по всем характеристиками FELs на данный момент существует г. Гамбург, Германия (X-FEL). Установка с линейным ускорителем длиной 1.7 км и общей длина: 3.4 км способна разгонять электроны до энергии 10-17.5 ГэВ с возможностью ее дальнейшего увеличения.Технология FELs позволяет использовать для рентгеноструктурного анализа микро- или даже нанокристаллы (по принципу «дифракция до разрушения»), а в идеале и отдельные макромолекулы, что открывает чрезвычайно заманчивые перспективы [52]. За фемтосекундное время экспозиции кристаллы не успевают получить значительных радиационных повреждений и, тем самым, снимаются ограничения по критической дозе облучения. В серийной фемтосекундной кристаллографии, микрокристаллы (200 нм-2 мкм) подаются в потоке жидкости поперек луча FELs. Таким образом, дальнейшие усовершенствование серийной синхротронной кристаллографии в сочетании с фемтосекундными методами выглядит весьма многообещающим и конкурентоспособным с XFEL.
Сегодня мы являемся свидетелями и участниками нового этапа развития структурных исследований, задачей которых является не только установление структур в фиксированном состоянии действительности, но и выявление очень быстрых межмолекулярных взаимодействий и внутримолекулярных преобразований с атомарной степенью детализации.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Область применения – медицина, фармакология, биотехнология, нейробиология, биохимические исследования, кристаллография белков.
Разрабатываемые и оптимизированные методы могут применяться на установке X-FELs, что предоставит доступ для структурных биологов к поточной кристаллографии без затрат значительного количества образца и ресурсов . Объединение разработанных методов с X-FEL будет иметь взаимовыгодный характер и приведет к более быстрому и лучшему анализу больших наборов данных, подготовки проб и определения их характеристик, а также подготовки специалистов-практиков в поточной кристаллографии.
Отобранные кандидатные антитела с оптимальными потребительскими свойствами будут поданы на конкурс работ Минпромторга РФ «Фарма 2020» для проведения доклинических и клинических испытаний. Структуры селектинов человека и мыши в комплексе с углеводными остатками сиалил-Льюис X и А, а также ГКС II, взаимодействующего с пептидными фрагментами МВР будут рассматривать в ходе НИР и контрактами с фармкомпаниями для разработки терапевтических средств при лечении РС и борьбе с метастазированием при онкологических заболеваниях.
Возможные потребители ожидаемых результатов, а также возможные пути и необходимые действия по доведению до потребителя ожидаемых результатов, в том числе на международной арене - Минпромторг РФ; Минобороны РФ; МВД РФ; МЧС РФ; Минздрав РФ; университеты и вузы РФ и ФРГ; научно-исследовательские профильные Институты, включая международные; отечественные и зарубежные фармацевтические компании.

Текущие результаты проекта:
1). Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках данного исследования, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты) - не менее 15 научно-информационных источников за период 2009 – 2013 гг.; выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96;
2). Разработан план исследований структурно-функционального изучения объектов молекулярной медицины комбинированными методами синхротронных излучателей и лазеров на свободных электронах;
3). Получены суб-библиотеки активных центров каталитических антител A17 и/или A5;
4). Получены генетические конструкции для препаративной экспрессии функционально активных каталитических антител, селектинов и Fra-2;
5). Проведен скрининг библиотек каталитических антител;
6). Проведены эксперименты по молекулярному моделированию, молекулярной динамики и квантово-механических расчетов (MD, QM) с использованием техники "докинга" функционально активных антител и предложен алгоритм предсказания наиболее активных мутантов с улучшенными потребительскими свойствами;
7). Получены оригинальные вектора для экспрессии Fab фрагмента антитела A5-HCh-His/pPicZαA и A5_kappa/pPICZαA и одноцепочечных антител pFuse scA17 FvFc и pFuse scA5 FvFc, которые использованы для экспрессии рекомбинантных антител A17 и A5, соответственно. Были получены штаммы продуценты Fab-фрагментов А5к_39 и А5lambda_9, подобраны условия экспрессии и очистки антител. Оптимальным вариантом было принято использование для индукции стартовой плотности культуры А600=5.0 и внесение метанола до 0,5% и сорбитола до 0,15 % каждые 24 часа на протяжении трех суток. Максимальный уровень продукции составил 23 мг/л и 17 мг/л, для антител A5kappa и A5lambda, соответственно. Уровень экспрессии одноцепочечных рекомбинантных каталитических антител составил 20 мг/л, специфическая активность которых была подтверждена кинетикой взаимодействия с фосфонатом Х. Таким образом, разработанная нами схема очистки позволяет получать гомогенные препараты рекомбинантных Fab-фрагментов антител (с чистотой не менее 95%), пригодных для кристаллизации;
8). Проведен скрининг суб-библиотеки активного центра антитела A17. Для скрининга был использована микрофлюидная технология с последующим отбором на приборе FACS ARIA III. Были отобраны пулы мутантных антител, показывающие более чем троекратное превышение сигнала флуоресцентного продукта над фоном. Проведено два раунда отбора с последующим посевом на агаровые чашках с селективной средой. После трехдневной инкубации, живые колонии смыты и заморожены в 50% глицерине для последующего анализа;
9). Наработаны экспериментальные партии рекомбинантных полноразмерного фактора транскрипции Fra2 и содержащих лектиновый и EGF домены фрагментов Е- и Р-селектинов мыши и человека в системе экспрессии на основе E.coli для дальнейших структурных исследований немецким партнером по проекту. Использованная методика получения белков, при необходимости, может быть напрямую применена для получения больших количеств белков - до 20 мг и выше.
10). Иностранным партнером в Европейской Молекулярной Биологической Лаборатории (EMBL, Гамбург, ФРГ) и Научном центре «Немецкий электронный синхротрон» (DESY, Гамбург) проведены запланированные исследования по уменьшению фона при анализе методом поточной кристаллографии на синхротроне. Были проанализированы различные методы снижения фона, такие как криогенное охлаждение кристалла предварительно помещенного в петлю, суспензии мелких кристаллов, микропленок и фибролитов, а также методы подготовки образцов толщиной субмикронных для криоэлектронной микроскопии. Основная задача данного исследования – удалить остаточные следы влаги из образца перед криогенным замораживанием, что обычно приводит к резкому снижению фона. Параллельно, проводили оптимизацию анализа отдельных моделей для улучшения оценки и коррекции фона. В результате исследований была оптимизирована система анализа, что позволило оценивать фоновый сигнал смежных анализируемых образцов.
11). Исследования по сокращению времени накопления данных и оптимизации анализа на синхротроне были также проведены немецким партером в Европейской Молекулярной Биологической Лаборатории (EMBL, Гамбург, ФРГ) и Научном центре «Немецкий электронный синхротрон» (DESY, Гамбург). Современный протокол сбора данных при анализе данных с X-FEL требует порядка 8 часов времени для концентрации пучка частиц в синхротроне и нескольких циклов оптимизации образца.
Проведенные исследования позволили осуществить регистрацию полной дифракционной картины образца за меньшее время.