Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
магнитные наночастицы, днк-аптамеры, биотиновые группы, аффинность нуклеопротеидных комплексов, молекулярное узнавание, броуновская релаксация, высокотемпературная сверхпроводимость (втсп), втсп сквид-магнитометр, нанотехнология изготовления.

Цель проекта:
В настоящее время в мировой практике комплекс антиген-антитело рассматривается как «золотой стандарт» специфического взаимодействия биомолекул. Это определило использование моноклональных антител (МА) в медицинской диагностике и терапии. Прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК в прикладных работах. До недавнего времени нуклеиновым кислотам приписывали лишь способность к приему и передаче информации, а также структурные свойства. Открытие энзиматических, а затем и регуляторных (ингибирующих) функций, расширило область использования и практического применения нуклеиновых кислот. Одним из быстро развивающихся направлений является разработка метода дизайна целевых молекул нуклеиновых кислот - аптамеров (от латинского Aptus – подходящий) - для изучения проблем нуклеиново-белкового узнавания. По способности образовывать специфический комплекс аптамеры, по сути, являются функциональными аналогами антител, поэтому создание аптамеров, обладающих ингибирующим или активирующим воздействием на белки, безусловно актуально. Чувствительной практической проблемой, на решение которой направлен реализуемый проект, является разработка недорогой портативной и чувствительной диагностической аппаратуры для быстрого проведения иммунного анализа в точке обслуживания пациента. Все существующие в настоящее время высокочувствительные методики проведения иммунного анализа на практике реализуются в биоаналитических лабораториях. Используемые приборы имеют большие размеры и высокую стоимость и не доступны в точке обслуживания пациента, а время, требуемое на анализ, исчисляется часами. Общей целью совместных прикладных научных исследований является разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии. Данная работа направлена на создание методик и аппаратуры для реализации безразделительной схемы иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц и чувствительного магнитометра, регистрирующего изменение скорости броуновской релаксации магнитных наночастиц при связывании присоединенных к ним аптамеров с белками-мишенями, как это делается для пары антитело-антиген. В прикладном плане разрабатываемая наносенсорная биомагнитная тест-система на основе магнитных наночастиц с иммобилизованными аптамерами к белкам, таким, например, как интерлейкин-6, а также Lon- протеаза, сопровождающая сборку онкобелков, будет основой нового поколения диагностической медицинской аппаратуры.

Основные планируемые результаты проекта:
К ожидаемым результатам поисковых научных исследований в рамках данного проекта относятся:
- получение белковых мишеней с различной молекулярной массой (от 22 kDa до 100 kDa);
- разработка методики получения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) со специфичными свойствами к конкретным белкам-мишеням;
- pазработка методики модификации ДНК-аптамеров биотиновой группой, их очистка;
- подготовка экспериментальных образцов аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК;
- лабораторная нанотехнология изготовления магнитометрического устройства (ВТСП СКВИД-магнитометра) для считывания результата анализа;
- методика и изготовление чипов трансформатора магнитного потока и ВТСП СКВИДа;
- методики нанесения буферных слоев и сверхпроводящего слоя на поверхность подложек, обеспечивающих согласование кристаллической структуры слоев на наноуровне;
- проектирование, сборка и отладка измерительной системы;
- разработка методики и проведение совместных измерений с биохимическим аналитом на разработанной измерительной системе.

Требования к выполняемым работам:
1 Должен быть выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках научных исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты) – не менее 15 научно-информационных источников за период 2009 – 2013 гг.
2 Должны быть выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
3 Должно быть проведено обоснование выбора направления исследований, методов и средств проведения исследований.
4 Должны быть разработаны физико-химические основы способов подготовки белковых мишеней и получения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров), обеспечивающие получение экспериментальных образцов, пригодных для использования в разрабатываемой в данном проекте наносенсорной биомагнитной тест-системе.
5 Должны быть разработаны основы теории модификации и очистки ДНК-аптамеров, обеспечивающие получение экспериментальных образцов, пригодных для использования в разрабатываемой в данном проекте наносенсорной биомагнитной тест-системе.
6 Должно быть проведено теоретическое исследование процесса присоединения биотинилированного ДНК-аптамера к магнитным частицам, обеспечивающее получение по итогам проекта установленных в данном ТЗ требований к экспериментальным образцам аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК.
7 Должна быть разработана методика исследования физических и химических характеристик (характеризации) экспериментальных образцов целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров), включая показатель поглощения и процентное содержание аптамеров в аналите.
8 Должна быть разработана методика исследования физических и химических характеристик (характеризации) экспериментальных образцов белковых мишеней с различной молекулярной массой, включая показатель поглощения и процентное содержание аптамеров в аналите.
9 Должна быть разработана методика исследования физических и химических характеристик (характеризации) экспериментальных образцов аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК.
10 Должны быть получены экспериментальные образцы целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) в количестве не менее 10 штук.
11 Должны быть получены экспериментальные образцы белковых мишеней с различной молекулярной массой в количестве не менее 10 штук.
12 Должны быть получены экспериментальные образцы аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК в количестве не менее 5 штук.
13Должна быть разработана методика нанесения буферных слоев и сверхпроводящего слоя на поверхность подложек, обеспечивающих согласование кристаллической структуры слоев на наноуровне.
14 Должны быть проведены исследования электрофизических характеристик (характеризация) ВТСП слоев и получены данные о критической температуре (ТC), ширине перехода в сверхпроводящее состояние (ΔТ), плотности критического тока (jС), влиянию магнитного поля на значение плотности критического тока.
15 Должны быть получены экспериментальные образцы чипов трансформатора магнитного потока и ВТСП СКВИДа в количестве не менее 2 штук.
16 Должны быть проведены расчеты величины полезного сигнала при различных размерах магнитных наночастиц, различных концентрациях в аналите и различных взаимных расположения СКВИДа и объема с аналитом с использованием специализированного программного комплекса PSCAN для анализа сверхпроводящих цепей.
17 Должен быть разработан экспериментальный образец измерительной ВТСП СКВИД-системы, составными частями которой являются:
— ВТСП СКВИД с трансформатором магнитного потока,
—электронные цепи вывода сигнала.
18 Должна быть разработана методика изготовления наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии, составными частями которой являются:
— измерительная ВТСП СКВИД-система,
— устройства подачи аналита в измерительную ВТСП СКВИД-систему,
— общий корпус.
19 Должен быть получен экспериментальный образец наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии.
20 Должны быть проведены по разработанной предварительно методике исследовательские испытания тест системы в целом и ее составных частей, позволяющие определить величину полезного сигнала в зависимости от размера магнитных наночастиц, их концентрации и взаимного расположения СКВИДа и объема с аналитом.
21 Должна быть разработана методика проведения совместных измерений с биохимическим аналитом на разработанной тест-системе, позволяющая проверить соответствие характеристик тест-системы требованиям ТЗ.
22 Должны быть проведены по отработанным методикам модельные эксперименты на биологических жидкостях (плазме, крови), позволяющие провести оптимизацию устройства подачи аналита в измерительную ВТСП СКВИД-систему.
23 Должны быть проведены по разработанным методикам измерения электрофизических характеристик магнитных частиц, а также экспериментальных образцов трансформаторов потока и ВТСП СКВИДа, позволяющие провести оптимизации технологического процесса создания измерительной ВТСП СКВИД-системы.
23 Должны быть проведены оптимизации технологического процесса создания измерительной ВТСП СКВИД-системы, обеспечивающие получение характеристик разрабатываемой тест-системы, отвечающей требованиям ТЗ.
24 Должны быть проведены обобщение и оценка полученных результатов, обеспечивающие возможность их последующего использования, в том числе при подготовке проектов ТЗ на проведение ПНИЭР по теме: «Разработка получения ДНК аптамеров как перспективного класса терапевтических агентов», «Разработка высоколинейного ВТСП детектора магнитного сигнала».
25 Должны быть поданы заявки на получение патента РФ в соответствии с процедурой, утвержденной законодательством Российской Федерации.
26 Должна быть выполнена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов.
27 Должны быть даны рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
28 Должно быть организовано участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию результатов исследований, позволяющее по итогам проекта опубликовать результаты разработок в не менее чем 7 статьях в научных журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки" (Web of Science).

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Разрабатываемые наносенсорные биомагнитные тест-системы на основе нуклеиновых кислот предназначены для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии и других задач медицины и экспериментальной биологии.
Создаваемая наносенсорная биомагнитная тест-система должна состоять из
— ВТСП СКВИД с трансформатором магнитного потока,
— держатель для исследуемого образца аналита,
— общий корпус.
Создаваемая наносенсорная биомагнитная тест тест-система и ее компоненты должна удовлетворять следующим требованиям:
— При разработке ВТСП СКВИДа, предназначенного для считывания результата анализа, должны быть получены многослойные ВТСП структуры с критическими температурами, ТС, слоев не менее 77 К.
— При разработке ВТСП СКВИДа, предназначенного для считывания результата анализа, должны быть получены многослойные ВТСП структуры с критическими плотностями тока не менее 1,5.104 А/см^2.
Создаваемая измерительная ВТСП СКВИД-система должна иметь уровень магнитного шума не более 2.10-4 квантов магнитного потока Ф0/Гц^1/2 на частоте 2 кГц.
Разрабатываемая наносенсорная биомагнитная тест-система должна быть рассчитана на получение полезного сигнала в различных возможных вариантах концентрации и размеров магнитных наночастиц в диапазоне от 50 нм до 1,5 мкм, размещения приемной петли трансформатора СКВИДа и объема с аналитом на расстояниях 50 и 500 мкм.
Создаваемые молекулы нуклеиновых кислот (аптамеров) предназначены для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии
Разрабатываемые методики получения целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) должны обеспечивать получение аптамеров с длиной 30 - 60 нуклеотидных остатков со специфичными свойствами к различным носителям инфекции.
Разрабатываемые методики пришивки специфических аптамерных комплексов к магнитным наночастицам должны обеспечивать эффективную пришивку к частицам с размерами в диапазоне от 50 нм до 1,5 мкм.
Масса разрабатываемых белковых мишеней должна лежать в диапазоне от 22kDa до 100kDa.
Методики модификации и очистки ДНК-аптамеров, характеризации структуры модифицированных ДНК-аптамеров и белковых мишеней с различной молекулярной массой, изучения комплексообразования ДНК-аптамера с белковой мишенью в растворе, присоединения биотинилированного ДНК-аптамера к магнитным частицам различного размера должны обеспечивать получение экспериментальных образцов, пригодных для использования в разрабатываемой в данном проекте наносенсорной биомагнитной тест-системе.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Области применения и способы использования ожидаемых научных и научно-технических результатов данного поискового исследования определены содержанием и целями проекта. Разработанный новый способ безразделительного иммуноанализа после его оптимизации будет применяться в биохимических лабораториях мира.
Безусловной областью применения полученных результатов будет биомедицинская практика. Связывание белка-мишени с магнитными частицами через аптамер поможет исследовать структуры эпитопов как цитокина, так и рецепторов, вычленяя отдельные домены, участвующие в этих процессах. С помощью иммобилизованного ДНК-аптамера можно будет разработать упрощенную тест-систему по определению концентрации белка интерликина-6 в плазме крови или Lon-протеазы в эпителиальных клетках.

Коммерциализации подлежит напосредственно разрабатываемая наносенсорная биомаг-нитная тест-система на основе магнитных наночастиц с иммобилизованными аптамерами. Однако, для практического использования в клинических условиях, жидкий азот должен быть заменен безжидкостной системой охлаждения. В рамках настоящего проекта был спроектирован и реализован прототип криокулера Джоуля-Томпсона (ДТ), основанный на коммерчески доступной системе Kryoz BV (Нидерланды), который должен удовлетворить данную потребность. Прототип включает так называемый “холодный палец” с интерфейсом оптимизированным для СКВИД задач и с прозрачным окном для интеграции с микрожидкостной системой. Общая потребность только нашей страны в подобных оптимизированных тест-системах составляет сотни единиц.

Текущие результаты проекта:
На первом этапе выполнения проекта были обоснованно выбраны направления исследований, методов и средств проведения исследований. На данном, втором, этапе в теоретическом плане были получены оценки на диапазон величины полезного сигнала при размере магнитных наночастиц 100 нм, в экспериментальном плане разработана общая структура измерительной ВТСП СКВИД- системы (см. Рисунок 1), включающая ВТСП СКВИД с трансформатором магнитного потока и электронные цепи вывода сигнала, получены образцы целевых молекул нуклеиновых кислот (аптамеров) со специфичными свойствами к конкретным белкам-мишеням. Разработаны методики характеризации структуры модифицированных ДНК-аптамеров и белковых мишеней включающая использование явления кругового дихроизма и плазмонного резонанса. Разработана методика присоединения биотинилированного ДНК-аптамера к магнитным частицам различного размера, отработаны условий связывания. показано, что присоединение биотинилированных ДНК-аптамеров к магнитным частицам составляет 15-20% от вносимого количества аптамеров.
Полученный ВТСП СКВИД имеет коэффициент преобразования по входу интерфе-рометра 40 мкВ/Ф0, в режиме замкнутой обратной связи его выходной сигнал соответствует 0.7 В/ Ф0 в полосе до 70 кГц. Разработанная методика характеризации белковых мишеней позволяет идентифицировать белки с различной молекулярной массой от 22,5 кДа (ИЛ-6) до 88,5 кДа (C-His-Lon).
Результаты получены в сотрудничестве с иностранным партнером, являющимся одним из мировых лидеров в разработках данного типа, и соответствуют мировому уровню.