Регистрация / Вход
Прислать материал

Структура и функции калиевых потенциалзависимых каналов и их мутантных форм, ответственных за развитие хронических сердечных и неврологических заболеваний

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
потенциал-ависимые ионные каналы, структура, функция, kv7, kv10, электронная микроскопия, петч-кламп, молекулярное моделирование, синдром удлиненного интервала qt, эпилепсия, аритмия, хронические заболевания

Цель проекта:
Изучение влияния мутаций на структуру и функции ионных каналов Kv7 и Kv10 при патологиях сердца и нервной системы и поиск потенциальных лигандов для терапевтических целей. Разработка методов фиттинга кристаллических структур в электронную плотность, полученную с помощью электронного микроскопа, для поиска низкомолекулярных терапевтических лигандов, нормализирующих деятельность человеческих потенциал-зависимых каналов.

Основные планируемые результаты проекта:
1)Будет разработана система экспрессии в эукариотических клетках и очистки функциональных белков человеческих ионных каналов дикого типа и с мутациями.
2)Мутантные каналы будут получены методом ПЦР и проанализированы методом петч-кламп в лаборатории Ж.Лоссарна (INSERM, Франция).
3)Структура ионных каналов Kv7 и Kv10 будет изучена с помощью электронной микроскопии.
4)Атомная структура отдельных доменов каналов (мембранного, цитоплазматических) будет получена в результате моделирования по гомологии с кристаллической структурой подобных доменов других каналов (Kv1.2, MlotiK, HCN).
5)Модели доменов будут встроены в электронную плотность, полученную в результате обработки ПЭМ изображений, для интерпретации положения их в полноразмерном белке канала.
6) Взаимное расположение цитоплазматических доменов в каналах Kv7 и Kv10 будет продемонстрировано с помощью построения разностных карт.
7) С использованием псевдо-атомной модели будут определены остатки, ответственные за ингибирование и активацию полноразмерных каналов.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1)Будут построены псевдо-атомные модели каналов Kv7 и Kv10 на основе данных ПЭМ и молекулярного моделирования. Знание пространственных структур полноразмерных каналов является важным шагом на пути к пониманию их функционирования. Рациональный поиск и дизайн новых лекарственных соединений нуждается в структурной информации о взаимодействиях прототипов лекарств с белком-мишенью.
Ранее расчеты молекулярной динамики проводились для каналов Kv7, однако было исследовано влияние лишь нескольких мутаций потенциалчувствительного домена. Для канала Kv10 подобные расчеты не проводились. Анализ опубликованной литературы показал, что имеется более 40 мутаций каналов Kv7 и 6 мутаций каналов Kv10, обнаруженных у больных с различными генетическими заболеваниями. Пространственная структура полноразмерных каналов Kv7 и Kv10 может быть использована для изучения молекулярных аспектов функционирования каналов дикого и мутантного типа, селективного связывания низкомолекулярных лигандов как потенциальных терапевтических агентов.
2) Для построения псевдо-атомных моделей каналов будет разработано новое программное обеспечение, являющееся первым отечественным продуктом для анализа биологических изображений по данным электронной микроскопии. На разработанную программу может быть получено свидетельство о приоритете.
3) На основе полученных нами структурных моделей каналов и с учетом данных, полученных французскими партнерами о физиологических изменениях в мутантных каналах, будет проведен первичный скрининг библиотек низкомолекулярных лигандов in silico.
В настоящее время в свободном доступе подобных библиотек нет, поскольку они являются коммерческой тайной и оберегаются фармацевтическими компаниями. В то же время стоимость реальной сфокусированной библиотеки потенциальных блокаторов канала Kv1.5 превышает 8 тыс. долларов США.
Метод виртуального скрининга используется более десяти лет, однако данных об исследованиях взаимодействий низкомолекулярных лигандов с каналами Kv7 и Kv10 нет. Это связано с ограниченной информацией о структуре каналов. Отбор низкомолекулярных веществ, селективно взаимодействующих с изучаемыми каналами, позволит предложить инновационные лекарственные средства.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Объем мирового рынка медицинских изделий и препаратов против сердечной аритмии оценивается в 2 млрд долларов в год с прогнозом увеличения до 3 млрд долларов в 2020 г. При этом объем мирового рынка мониторинга последствий сердечной аритмии составляет 2 биллиона долларов ежегодно.
Изучение структурных и функциональных свойств калиевых потенциал-зависимых каналов позволит понять механизмы, приводящие к нарушению функционирования этих каналов вследствие появления точечных мутаций. Понимание этих механизмов, в свою очередь, приведет к созданию научно-обоснованных методов направленной коррекции активности каналов для нормализации их функции.
Известно, что каналы Kv7 вовлечены в возникновение ряда наследственных заболеваний. Кроме того, эти каналы являются общепризнанной мишенью для создания болеутоляющих средств и перспективной мишенью для агентов, нормализующих функционирование гладкой мускулатуры. Особая привлекательность терапевтического воздействия на каналы Kv7 состоит в том, что разные изоформы демонстрируют специфическую экспрессию в различных тканях, что позволит обеспечить достаточный лечебный эффект при минимальном побочном действии. Вместе с тем, в настоящее время в медицинской практике нашли применение лишь несколько препаратов, действующих на каналы Kv7. Понимание структурно-функциональной связи в этих каналах позволит с новой стороны подойти к модулированию функции каналов с помощью лекарственных средств.
С другой стороны, изучение структуры каналов Kv10 и их биологической роли только начинается, но уже доказано, что ряд мутаций в этих каналах может привести к тяжелым дегенеративным заболеваниям, а также показано участие данных каналов в пролифирации и образовании раковых клеток. Можно полагать, что детали структурной организации каналов Kv10, полученные при работе над настоящим проектом, позволят определить возможность терапевтического воздействия для лечения подобных заболеваний.
Ближайшие последствия реализации проекта – формулировка рекомендаций для дальнейшей ОКР для проведения доклинических испытаний выбранных низкомолекулярных соединений. Будет также составлена заявка на финансирование совместного проекта на международном уровне (например, Human Frontiers Research Gate http://www.hfsp.org/). Долгосрочные последствия реализации проекта – внедрение новых препаратов в широкую медицинскую практику и использование их для лечения хронических сердечных и неврологических заболеваний, в том числе с применением контролируемой доставки.

Текущие результаты проекта:
В соответствии с календарным планом на 1 этапе был проведен сравнительный анализ существующих подходов к структурно-функциональным исследованиям молекул ионных каналов и обоснование выбора методик для решения поставленных в проекте задач. Выбор методик и обсуждение направления исследования проводились вместе с французскими партнерами в ходе международного совещания.
В канале Kv10 были выбраны мутации, находящиеся в области S4-S5 линкера (G348R) и ворот канала (I467V). Эти аминокислотные замены повышают функцию каналов.
В канале Kv7 были выбраны для анализа две мутации: аминокислотная замена S140G, приводящая к сдвигу в сторону негативных потенциалов и R539W, приводящая к нарушению модулирования канала полярными липидами.
В качестве платформы для разработки программного обеспечения для построения псевдо-атомных моделей каналов Kv7 и Kv10 на основе данных ПЭМ была выбрана среда IMP, реализованная на языках Python и C++.
Проводились патентные исследования, в соответствии с ГОСТ 15.011-96. Препятствий для получения охранных и иных документов на разрабатываемое программное обеспечение нет.