Регистрация / Вход
Прислать материал

Исследование пространственной структуры белков, контролирующих архитектуру генома и регуляцию экспрессии генов у эукариот, с использованием возможностей Европейского центра синхротронного излучения

Номер контракта: 14.616.21.0045

Руководитель: Попов Владимир Олегович

Должность руководителя: директор

Докладчик: Бойко Константин Михайлович, с.н.с.

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
структурная биология, синхротронное излучение, пространственная структура, архитектура генома, инсулятор

Цель проекта:
1. Пространственная организация генома имеет важное значение в процессах поддержания архитектуры ядра и регуляции всех процессов, происходящих в нем. Известно, что в процесс регуляции транскрипции у эукариот вовлечены многочисленные элементы генома, зачастую расположенные на значительном расстоянии друг от друга. В последние несколько лет была сформирована концепция, согласно которой существует особый класс архитектурных белков, в числе которых и известные инсуляторные белки, участвующих в организации общей архитектуры хромосом, а также в локальном контроле энхансер-промоторных взаимодействий. Предполагается, что данные белки способны устанавливать дистанционные взаимодействия, а также привлекать различные белковые многокомпонентные комплексы, которые, в частности, могут менять статус окружающего хроматина, однако соответствующие структурные данные и механизмы действия архитектурных белков до сих пор неизвестны. Исходя из этого, особый интерес представляют те архитектурные белки, которые способны, напрямую или путем привлечения других белков-партнеров, формировать белковые комплексы. Данное свойство, с одной стороны, делает возможным специфичное и эффективное сближение дистанционно разделенных регуляторных элементов генома, а с другой - позволяет разделять хроматиновые домены за счет образования хромосомальных петель. Очевидный недостаток структурной информации существенно тормозит развитие исследований в части изучения пространственной организации генома и механизмов регуляции экспрессии генов. Помимо фундаментальной составляющей, такие данные имеют и прикладной интерес. Так, известно, что нарушения, происходящие на уровне архитектуры хромосом, часто напрямую связаны с развитием многих заболеваний человека. Полученные в результате выполнения проекта структурные данные позволят глубже исследовать механизмы протекания заболеваний, связанных с такими нарушениями архитектуры хромосом как, например, онкогенные хромосомные перестройки. 2. Целью проекта является исследование пространственных структур белков эукариот, контролирующих архитектуру их генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов. Для этой цели будут использованы возможности Европейского центра синхротронного излучения в части проведения рентгеноструктурного эксперимента.

Основные планируемые результаты проекта:
1. Основными планируемыми результатами проекта являются архитектурные белки (и/или их структурные домены), полученные в количестве и с чистотой, пригодной для их структурных исследований методом рентгеноструктурного анализа, а также их пространственные структуры.

2. Основными характеристиками планируемых результатов являются:
2.1 Архитектурные белки должны быть получены в количествах не менее 1 мг с чистотой не ниже 90%.
2.2. Пространственные структуры архитектурных белков (не менее одной) должны быть получены с разрешением не хуже 3.5А.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом выполнения проекта будут новые знания о пространственном строении архитектурных белков эукариот. Очевидный недостаток структурной информации существенно тормозит развитие исследований в части изучения пространственной организации генома и механизмов регуляции экспрессии генов.

2. Высокий уровень новизны полученных результатов определяется тем фактом, что в настоящее время структурные данные о белках и мультибелковых комплексах, контролирующих архитектуру генома и регуляцию экспрессии генов у эукариот, практически отсутствуют.

3. В виду практически полного отсутствия структурных данных по архитектурным белкам, полученные результаты будут соответствовать мировому уровню в данной области.

4. Для получения отобранных объектов исследования будут использованы созданные ранее в качестве научного задела различные генетические конструкции, обеспечивающие получение гомогенных белков (и/или их доменов) в требуемых для структурных исследований количествах. Выделение и очистка объектов исследования будут проведены с использованием различных методик жидкостной хроматографии, включая металло-хелатную и гель-фильтрационную. Последняя также будет использована для контроля гомогенности полученных целевых белков. При необходимости будут проведены дополнительные работы по подбору условий, в которых целевые белки будут конформационно гомогенны.
Широкий скрининг условий кристаллизации очищенных целевых белков будет проводиться методом диффузии в парах («сидячая капля») с последующей оптимизацией условий, в которых наблюдается рост кристаллов.
Структурные исследования будут проведены методом рентгеноструктурного анализа с использованием инфраструктуры Европейского Центра Синхротронного излучения. Дифракционные наборы будут сняты на станции с микрофокусным пучком ввиду ожидаемо малого размера выросших кристаллов. Планируется, что решение полученных структурных данных будет проведено методом молекулярного замещения.
Основные риски при выполнении данного проекта связаны с непредсказуемостью процесса кристаллизации исследуемых белков. Для уменьшения данного риска будет проведен скрининг условий кристаллизации в широких пределах.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Помимо фундаментальной составляющей, результаты работы имеют и прикладной интерес. Известно, что нарушения, происходящие на уровне архитектуры хромосом, часто напрямую связаны с развитием многих заболеваний человека. Полученные в результате выполнения проекта структурные данные могут быть использованы в биомедицине, т.к позволят глубже исследовать механизмы протекания заболеваний, связанных с такими нарушениями архитектуры хромосом как, например, онкогенные хромосомные перестройки.

2. Получаемые результаты носят преимущественно фундаментальный характер, в связи с чем практического применения полученных результатов в рамках проекта не предусмотрено.

3. В виду фундаментальности проекта оценка влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений видится преждевременный.


Текущие результаты проекта:
На сегодняшний момент проведены следующие работы по проекту:

1. Проведены патентные исследования.
2. Отобраны архитектурные белки (и их структурные домены) из модельного организма D.melanogaster.
3. Отобранные белки получены в количестве и с чистотой, пригодной для их структурных исследований методом рентгеноструктурного анализа.
4. проводится работа по широкому скринингу условий кристаллизации полученных белков.