Регистрация / Вход
Прислать материал

Изучение биологической опасности нетермического воздействия терагерцового излучения на бактерии и клетки человека

Номер контракта: 14.616.21.0053

Руководитель: Пельтек Сергей Евгеньевич

Должность: Зам. директора по научной работе

Организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук"
Организация докладчика: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук"

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
терагерцовое излучение, геносенсоры, клетки человека, тест эймса, генотоксичность, протеомный анализ, масс-спектрометрия

Цель проекта:
Целью работы является изучение биологических эффектов нетермического воздействия терагерцового излучения на модельных объектах: бактериях Escherichia coli, тестовой системе Эймса на бактериях Salmonella typhimurium а также на культуре эпителиальных клеток человека с целью определения степени биологической опасности данного вида излучения для человека и изучение влияния эффективности процессов репарации ДНК на чувствительность клеток человека к терагерцевому излучению.

Основные планируемые результаты проекта:
Изучение влияния терагерцового излучения на живые объекты имеет большое научно-практическое значение в связи с все более широким применением терагерцового излучения в практике и возможными последствиями этого применения. Отсутствие непосредственного контакта с терагерцовым излучением живых объектов в естественных условиях делает необходимым поиск и изучение специфических или общих защитных систем организмов реагирующих на присутствие терагерцового излучения, аналогично системам репарации и SOS-ответа живых объектов на ионизирующее электромагнитное излучение. Индивидуальные особенности систем репарации ДНК могут приводить к повышенной чувствительности к излучению, в связи с этим представляется важным исследовать влияние эффективности репарации на чувствительность клеток человека к терагерцевому излучению.
Будет создан база список генов реактивных по отношению к терагерцовому излучению. Создан геносенсор индуцирующийся в ответ на нетермическое воздействие терагерцового излучения.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Будет изучена динамика ответа на воздействие терагерцового излучения геносенсоров на основе промоторов генов E. coli, чувствительных к окислительному стрессу, присутствию в среде ионов металлов и антибиотиков.
2. Будут определены виды стрессовых систем E. coli, задействованных в ответе на терагерцовое излучение.
3. При помощи теста Эймса будет определена способность терагерцового излучения в зависимости от дозы индуцировать мутации в геноме прокариот.
4. При помощи SOS–хромотеста будет определена генотоксичность терагерцового излучения для клеток E.coli.
5. Методом РНК-секвенирования [RNA seq] будут получены транскрипционные профили E. coli под нетермическим воздействием терагерцового излучения и без воздействия в качестве контроля.
5. С использованием кинетики ответа геносенсоров методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле будут выявлены фракции белков E. coli быстрого и пролонгированного ответов, меняющие уровень экспрессии в результате нетермического воздействия терагерцового излучения.
6. Будет проведена идентификация белков E. coli, вовлеченных в ответ на воздействие терагерцовым излучением по их пептидной карте масс методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
7. Будет сконструирован и протестирован геносенсор на основе промотора гена, экспрессия которого в результате воздействия нетермического терагерцового излучения меняется (увеличивается) наиболее выраженно.
8. С использованием результатов протеомного и транскриптомного профилирования будет сформирован список генов и проведен его биоинформационный анализ для выявления биологических механизмов воздействия терагерцового облучения на живые объекты.
9. Будет проведен протеомный анализ белков клеток человека с пониженной способностью к репарации ДНК с целью идентификации селективных маркеров, индуцируемых при повреждении ДНК. (работы выполняются сотрудниками Оксфордского Университета)

10. Методом вестерн-блот анализа будет проведена оценка индукции идентифицированных селективных маркеров в ответ на воздействие терагерцовым излучением. (работы выполняются выполняются совместно с сотрудниками Оксфордского Университета)

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Основная область применения результатов предлагаемого проекта - биобезопасность неионизирующих излучений. Современное общество немыслимо без использования приборов и оборудования с излучением в различных диапазонах электромагнитного спектра, что является одним из факторов антропогенного воздействия на окружающую среду и, наряду с выбросами углекислого газа, химических соединений, тяжелых металлов и др., источником ее загрязнения. Аналогично ПДК для различных токсических соединений, для излучений также существуют предельно допустимые значения плотности потока энергии электромагнитного излучения. Но если для ультрафиолета, рентгена и радиоактивного излучения, негативное воздействие на живые организмы хорошо изучено и определены допустимые дозы, что показано в многочисленных научных работах, для излучений в иных диапазонах электромагнитного спектра нет прямых ответов на вопрос о механизмах воздействия на биологические объекты. В последние несколько десятилетий произошел прорыв в области разработки новых источников и в настоящее время на базе терагерцового излучения разрабатывается целый ряд приборов для имиджинга и детекции. Однако до внедрения приборов в повсеместную практику, необходимо тщательно изучить эффекты воздействия этого излучения на живые объекты и оценить параметры излучения как безвредные, так и предельно допустимые для облучения человека.

Текущие результаты проекта:
Настоящий проект направлен на исследование биологических последствий терагерцового облучения живых объектов. Для этого в ИЦиГ СО РАН уже разработаны приемы и методы облучения живых объектов терагерцовым излучением, а также методы регистрации клеточного ответа на эти виды стресса при помощи геносенсорных конструкций.
Для экспонирования биологических образцов разработана и изготовлена специальная кювета с прозрачными в терагерцовой области полипропиленовыми окнами. Для обеспечения равномерного экспонирования образца по всему объему кювету вращают с помощью специального механизма. Для контроля температуры жидких образцов при поглощении терагерцового излучения используют высокочувствительный тепловизор ТКВр-СВИТ101 с возможностью динамической регистрации изменения температурных полей.
Для изучения клеточных процессов, вовлеченных в развитие ответной реакции на терагерцовое излучение, в ИЦиГ СО РАН сконструированы геносенсорные плазмидные конструкции, позволяющие описывать динамику развития ответа стрессорных систем Е. coli в реальном времени (Peltek et al., 2011). Отработаны и усовершенствованы молекулярно-биологические методики по клонированию промоторов в базовый гибридный вектор, в котором объединены фрагмент плазмиды pUC18 и ген флюоресцентного белка GFP. Для клонирования используется методика Uracil excision-based cloning, позволяющая значительно упрощать процедуру, при этом значительно увеличивая эффективность клонирования. Данная методика заключается в том, что для получения ПЦР-фрагментов используются праймеры содержащие урацил вместо тимина на расстоянии 6-8 п. н. от 5’-конца. При помощи фермента Урацил – ДНК - гликозилазы урацил выщепляется и образуются достаточно длинные липкие концы, обеспечивающие более точную встройку нужного фрагмента.
Основываясь на том факте, что в терагерцовом диапазоне лежат частоты колебаний водородных связей и вандерваальсовых сил межмолекулярного взаимодействия, нами была принята гипотеза о том, что излучение может индуцировать некоторые гены, детерминирующие защитные механизмы клеток E.coli, аналогичные ответу на окислительный стресс. Для проверки этой гипотезы нами в ИЦиГ СО РАН был протестирован геносенсор E.coli/pKatG-gfp, чувствительный к окислительному стрессу, специфическим индуктором для которого является перекись водорода. Благодаря использованию биосенсорной конструкции, в ИЦиГ СО РАН было установлено, что облучение клеток E.coli/pKatG-gfp терагерцовым излучением с длиной волны 130 мкм и плотностью мощности 1.4 Вт/см2 в течение 15 мин активирует генную сеть окислительного стресса. Через 200 минут после облучения терагерцовым излучением уровень флуоресценции GFP-белка в клетках E.coli/pKatG-gfp был в пять раз больше, чем индуцированный перекисью водорода – естественным индуктором для данной геносенсорной конструкции. При этом облучение геносенсора в течение 5 и 10 минут при тех же параметрах излучения не приводит к ярко выраженному ответу в виде увеличения интенсивности флюоресценции [Demidova et al., 2013].
Для изучения клеточных процессов, вовлеченных в развитие ответной реакции на терагерцовое излучение, в ИЦиГ СО РАН сконструирован ряд геносенсоров позволяющих описывать динамику развития ответа таких стрессорных систем Е. coli как, окислительный стресс, реакцию на присутствие ионов металлов и салициловой кислоты в реальном времени. На основе кинетических параметров этой реакции стало возможно проводить протеомные исследования опираясь на измерение времени реакции стрессовых систем. В ИЦиГ СО РАН начаты работы по изучению влияния терагерцового излучения на экспрессию белков методами протеомного анализа. Разработаны высоко воспроизводимые методы построения и сравнения двумерных карт экспрессии белков для протеомов бактерий и человека. Для наиболее точного количественного определения изменений белковой экспрессии отработан метод окраски гелей флуоресцентным красителем Sypro Ruby, для которого характерна высокая чувствительность, линейная (в пределах трех порядков величины) зависимость от концентрации белка и полная совместимость с масс-спектрометрическим анализом (Mescheryakova et al., 2014)._
Полученные результаты дают основания предполагать, что воздействие терагерцовым излучением активирует защитные механизмы клетки, которые лишь частично перекрываются с ответом на окислительный стресс. Возможно, что в основе реакции на терагерцовое излучение лежат иные механизмы активации, задействованы другие транскрипционные факторы.
Методами протеомного анализа, используемыми в Оксфордском университете, изучены характерные изменения экспрессии белка ARF, вызываемые повреждениями ДНК в культуре клеток человека (Orlando et al., 2014). В лаборатории др. Б. Кесслера отработаны методы количественной протеомики, пригодные для определения белков-маркеров, индуцируемых при повреждении геномной ДНК в клетках эпителия человека (Khoronenkova et al., 2012).
Для проведения запланированных исследований необходим источник, который позволяет в широких пределах менять длины волн, среднюю и пиковую мощности, временные характеристики и другие параметры терагерцового излучения. Для проведения экспериментов будет использован Новосибирский лазер на свободных электронах терагерцового диапазона. Лазер обладает рекордным в мире параметрами терагерцового излучения по средней мощности (до 500 Вт), пиковой мощностью до 1МВт и плавно перестраиваемым длиной волны излучения от 50 до 240 микрон. Источник не имеет аналогов в мире и позволяет проводить уникальные эксперименты, поэтому большинство работ в РФ по изучению терагерцового излучения сосредоточено в Сибирском центре синхротронного и терагерцового излучения.