Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка новых методов экспрессной детекции био- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения

Аннотация скачать
Постер скачать
Ключевые слова:
иммуноанализ, предел обнаружения, иммунные комплексы, контроль продуктов питания, контроль продукции животноводства.

Цель проекта:
Цель выполнения научно-исследовательской работы – разработать и апробировать новые эффективные методы специфического выявления био- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов в пищевой продукции. Для обеспечения экспрессности тестирования предполагается использование флуоресцентных зондов, что позволит регистрировать формирование иммунных комплексов в режиме реального времени, без дополнительных инкубаций и стадий генерации сигнала. Планируется провести теоретическое и экспериментальное сопоставление различных маркеров и схем регистрации аналитического сигнала и на основании полученных данных создать тест-системы для контроля присутствия в продуктах животноводства токсичных антибактериальных препаратов.

Основные планируемые результаты проекта:
В рамках исследования общих закономерностей функционирования иммуноаналитических систем с использованием флуоресцентных маркеров будут установлены оптические и иммунохимические свойства иммунореагентов для контроля низкомолекулярных соединений, меченных флуорофорами; определены параметры взаимодействий между реагентами в иммуноаналитических системах; проведена оценка влияния различных матриксов на регистрируемые флуоресцентные характеристики биоспецифических взаимодействий; выбраны и обоснованы критериев для сопоставления новых кандидатных флуорофоров.
Результатом применения установленных общих закономерностей для контроля конкретных пищевых токсикантов будет создание и характеристика тест-систем для мониторинга присутствия и уровня двух значимых классов ветеринарных фармпрепаратов – бактериостатиков и бета-агонистов. Тест-системы будут реализованы на основании полученных данных о свойствах флуоресцентных маркеров и их конъюгатов. Будут проведены сравнительная оценка результатов применения новых флуоресцентных маркеров, характеристика точности и воспроизводимости измерений содержания низкомолекулярных токсикантов, оценка селективности тест-систем, изучение их стабильности при разных режимах хранения.
Эффективность разработанных методик будет подтверждена испытаниями на репрезентативных выборках проб, составленных с учетом приоритетов РФ и ЕС. Будет изучена корреляция результатов, получаемых разработанными иммунохимическими и массово используемыми хроматографическими методами; проведена оценка преимуществ новых аналитических систем. На основании результатов апробации будут подготовлены предложения по внедрению в практику новых тест-систем.

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
Разрабатываемая тест-система для определения бета-агонистов должна обеспечивать выявление следующих структурно близких основных представителей этой группы пищевых токсикантов: кленбутерола, раптоламина, орципреналина, тербуталина, фенотерола, сальбутамола, фегнотерола, осуществляя тем самым класс-специфическое определение суммарного содержания этих веществ в одной аналитической реакции и с использованием одного маркера.
Разрабатываемая тест-система для определения бактериостатиков должна обеспечивать выявление следующих структурно различных и относящихся к различным химическим классам соединений, приоритетных при получении сельскохозяйственной продукции: хлорамфеникола, линкомицина, клиндамицина, тетрациклина, окситетрациклина, осуществляя тем самым индивидуальное определение каждого из химических классов бактериостатиков в нескольких аналитических реакциях с использованием одного или нескольких маркеров.
Тест-системы должны быть основаны на гомогенном иммунохимическом взаимодействии их компонентов с токсикантом в пробе и применении флуоресцентных маркеров, конъюгируемых с иммунореагентами и позволяющих детектировать целевые токсиканты по флуоресценции образующихся межмолекулярных комплексов.
Тест-системы должны обеспечивать достоверное выявление присутствия в пробах вышеперечисленных бета-агонистов и бактериостатиков в концентрациях от 10 нг/мл (хлорамфеникола – от 0,3 нг/мл).
Тест-системы должны быть пригодны для контроля пищевых продуктов животного происхождения (молоко, мясо, продукты их переработки) с использованием бесприборной пробоподготовки, продолжительность которой составляет не более 10 мин. Общее время тестирования, включая пробоподготовку, не должно превосходить 20 мин.
Тест-системы должны обеспечивать количественное определение контролируемых токсичных контаминант с полнотой выявления аналитов в пищевых матриксах не менее 90% и варьированием результатов измерений, не превосходящим 12% (среднеквадратичное отклонение для выборок не менее чем из 5 проб).
Эффективность работы тест-систем должна быть установлена на репрезентативной выборке, состоящей не менее чем из 40 проб и включающей менее 5 вариантов пищевой продукции. В рамках этих испытаний, проводимых совместно с итальянским партнером, должна быть показана корректность выводов о присутствии или отсутствии контаминанта (в соответствии с установленным пороговым уровнем его содержания) не менее чем в 95% случаев, а коэффициент корреляции количественных данных, получаемых разработанными иммунохимическими и референсными хроматографическими методами, должен составлять не менее 0,9.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
Проект направлен на создание и апробацию прототипов аналитических систем, предназначенных для масштабируемого производства и внедрения в практику. Определяемые в рамках проекта соединения - бета-агонисты и бактериостатики - относятся к токсичным пищевым контаминантам. Разрабатываемые изделия (тест-системы) предназначены для использования в работе служб сельскохозяйственного и санитарно-эпидемиологического контроля, в системе Роспотребнадзора, в производственных лабораториях предприятий пищевой промышленности.
Разработка имеет принципиальные методические отличия от других известных в настоящее время средств иммунохимического анализа, прежде всего – от доминирующих в аналитической практике иммуноферментных тест-систем. Использование флуоресцентных маркеров позволяет с высокой чувствительностью регистрировать непосредственно момент образования иммунных комплексов, без дополнительных инкубаций, этапов развития и усиления детектируемого сигнала. Данный подход реализуется в существующих тест-системах для поляризационного флуороиммуноализа, но ограничен единственной меткой (флуоресцеин), требует регистрации не самой флуоресценции, а более сложного параметра – деполяризации при излучении плоскополяризованного света источника возбуждения, а кроме того – чувствителен к компонентам тестируемого матрикса. Планируемые исследования различных маркеров и форматов анализа, а также использование существующего у партнеров задела позволяют преодолеть эти ограничения.
В настоящее время отечественный рынок средств внелабораторной детекции пищевых токсикантов формируется исключительно импортируемыми тестами. Аналитические характеристики планируемых к разработке тест-систем обеспечат высокую конкурентоспособность и возможность замены импортной продукции, а также, совместно с иностранным партнером, - выход отечественных тест-систем на новые площадки рынка.

Текущие результаты проекта:
Работы по проекту в 2015 г. проводились по трем направлениям и включали:
1) общий теоретический и экспериментальный анализ возможностей регистрации различных флуоресцентных маркеров;
2) формирование и характеристику реагентной базы для предлагаемых новых иммуноаналитических систем
и 3) координацию с итальянским партнером требований к тест-системам, к методикам проведения экспериментов и формам представления полученных результатов, к структуре совместной экспериментальной работы.
Все работы, предусмотренные на текущий год, выполнены в полном объеме.
По первому направлению работ подготовлен обзор научно-технической литературы, рассматривающей вопросы биоаналитического применения флуоресцентных маркеров; проведены патентные исследования для оценки современного уровня разработок и востребованности предлагаемых к реализации новых методических решений; теоретически и экспериментально изучено влияние свойств флуоресцентных маркеров на эффективность их детекции. На основании результатов выполненного анализа выбраны и обоснованы наиболее эффективные форматы иммунодетекции низкомолекулярных аналитов с использованием флуоресцентных маркеров.
По второму направлению работ проведена характеристика аффинности и селективности немодифицированных антител против бета-агонистов и бактериостатиков, применяемых в разрабатываемых аналитических системах; отобранные препараты антигенов и антител были конъюгированы с низкомолекулярными и нанодисперсными флуоресцентными маркерами при разных условиях проведения реакции; определены кинетические и равновесные параметры взаимодействий между компонентами планируемых к разработке тест-систем.
По третьему направлению работ осуществлены подготовка и паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов для совместных с итальянской стороной экспериментов; согласованы с итальянской стороной требования к протоколам проведения экспериментов и формам представления результатов.
Полученные результаты подтверждают эффективность предложенных подходов к созданию высокочувствительных иммуноаналитических систем и формируют необходимую реагентную базу для решения следующих задач проекта.