Регистрация / Вход
Прислать материал

Идентификация и гетерологичная продукция ферментов, гидролизующих ксилоглюкан в растительной биомассе

Номер контракта: 14.628.21.0001

Руководитель: Яроцкий Сергей Викторович

Должность: Заместитель директора по науке

Организация: федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт"
Организация докладчика: Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов"

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Ключевые слова:
ксилоглюканаза, ксилоглюкан, растительная биомасса,ферменты, библиотека клонов, гетерологичная экспрессия, clostridium stercorarium, pichia, bacillus

Цель проекта:
1. Реализуемый проект направлен на решение проблемы утилизации растительной биомассы, которая является наиболее распространенным возобновляемым источником углерода. Однако ее огромный потенциал используется недостаточно эффективно по причине отсутствия полного спектра ферментов, необходимых для комплексного расщепления растительных полисахаридов, а также их недостаточной изученности. Расширение арсенала гликозил гидролаз, обладающих высокой специфической активностью, необходимо для высокоэффективной биоконверсии природного растительного сырья, отходов его промышленной и сельскохозяйственной переработки. Ксилоглюкан (КГ) – один из основных структурных и запасающих полисахаридов двудольных и некоторых однодольных растений. Эффективный гидролиз КГ – необходимое условие для последующей полной деградации растительной биомассы до сахаров. КГ может также служить ценным источником разнообразных олигосахаридов для пищевой, кормовой, фармацевтической промышленности и производства пищевых добавок. Несмотря на высокое содержание КГ в растительной биомассе, мы до сих пор имеем ограниченное представление о гидролизующих его ферментах, а механизмы гидролиза КГ недостаточно изучены. Поэтому актуальной задачей является поиск новых ксилоглюканаз, обладающих промышленно-важными свойствами и конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов этих ферментов. 2. Целью реализуемого проекта является создание штаммов-продуцентов новых и улучшенных ксилоглюканаз для более полной и эффективной конверсии растительной биомассы.

Основные планируемые результаты проекта:
1. В рамках проекта должны быть получены следующие результаты:
• Должны быть получены опытные образцы чистых культур рекомбинантных грибных штаммов-продуцентов новых ксилоглюканаз (не менее трех).
• Должны быть получены лабораторные образцы ксилоглюканаз.
• Должны быть получены лабораторные образцы ксилоглюканов различной структуры (арабино- и фуко- XXXG-тип; XXXGn-тип) растительного происхождения.
• Должны быть сконструированы экспрессионные системы (векторы) для биосинтеза ксилоглюканаз в штаммах.
• Должна быть разработана методика получения микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз.
• Должна быть разработана методика оценки продуктивности микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз.
• Должна быть разработана методика оценки функциональной активности рекомбинантных ксилоглюканаз.
• Должны быть разработаны методические рекомендации по применению новых рекомбинантных ксилоглюканаз.
2. Штаммы-продуценты рекомбинантных ксилоглюканаз должны обладать следующими характеристиками:
- Штаммы должны продуцировать секретируемый нативный белок, обладающий целевой ферментативной активностью;
- Диапазон продуктивности для рекомбинантных штаммов должен составлять 0,5-5 г/л целевого белка;
Лабораторные образцы ксилоглюканаз должны обладать следующими характеристиками:
- содержание рекомбинантного фермента в нативном состоянии не менее 90%;
- при инкубации в течение 2 часов при 50°С должно сохраняться не менее 50% ферментативной активности;
Экспрессионные системы (векторы) для биосинтеза ксилоглюканаз в грибных штаммах должны обладать следующими характеристиками:
- Экспрессионные системы (векторы) для биосинтеза ферментов должны быть сконструированы на основе интегративных экспрессионных векторов, обеспечивающих высокоэффективную специфическую продукцию в Pichia pastoris.
Лабораторные образцы ксилоглюканов растительного происхождения должны быть получены из доступных видов регионального сырья и иметь структуру арабино- и фуко- XXXG-типа и XXXGn-типа

Краткая характеристика создаваемой/созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции:
1. Конечным продуктом должны быть лабораторные образцы рекомбинантных грибных ксилоглюканаз, при инкубации которых в течение 2 часов при 50 °С должно сохраняться не менее 50% активности.
Рекомбинантные ксилоглюканазы в дальнейшем могут быть использованы для получения продуктов с высокой добавочной стоимостью, таких как спирты и органические кислоты, которые производятся путем сбраживания продуктов ферментативного гидролиза растительного субстрата. При этом процессы биоконверсии с использованием рекомбинатных ферментов более экологически безопасны по сравнению с кислотным гидролизом, а стоимость промышленных ферментов постоянно снижается. Новые ксилоглюканазы могут находить применение в составе ферментных комплексов, получаемых непосредственно из культур штаммов-продуцентов.
2. Оценка элементов новизны научных (технологических) решений, применявшихся методик.
В рамках проекта, впервые проведен скрининг крупнейшей в РФ коллекции микроорганизмов ВКПМ, содержащей 607 грибных штаммов, выделенных из различных источников либо полученных лабораторно, с целью поиска новых ксилоглюканаз. Впервые были найдены новые термостабильные ксилоглюканазы в ранее неохарактеризованных грибных штаммах. Впервые ксилоглюкан различных типов был получен из разных видов доступного растительного сырья.
3. Сопоставление с результатами аналогичных работ, определяющими мировой уровень.
Анализ источников научно-технической и патентной информации выявил высокую актуальность исследований, направленных на поиск и гетерологичную экспрессию генов ферментов ксилоглюкан-специфичных гликозил-гидролаз. При этом поиск новых генов ксилоглюканаз ведется методами молекулярной генетической инженерии с осуществлением первичного биохимического скрининга. Патентной защитой стараются обеспечить не только биохимически и генетически охарактеризованные ферменты, но и предсказанные гены возможных ксилоглюканаз, выявленные методами высокопроизводительного секвенирования геномов. Разнообразие представленных в литературе продуцентов и ферментов, а также фактическое отсутствие кросс-патентования указывает на неисчерпанные возможности поиска природных ксилоглюканаз. Основная тенденция области – это дальнейший поиск новых генов ксилоглюканаз среди многообразия представителей царства грибов.
4. Пути и способы достижения заявленных результатов, ограничения и риски.
Для создания эффективных продуцентов ксилоглюканаз приоритетным направлением является конструирование штаммов на основе хорошо зарекомендовавших себя платформ и оптимизация структуры генов под конкретного носителя.
Для достижения поставленных результатов будут использованы классические методы микробиологии, биохимии, молекулярной биологии и генной инженерии.
Для выделения ксилоглюканов из различных видов растительного сырья будут применяться методы экстракции, разработанные, в зависимости от типа сырья, на основе общих принципов и подходов к очистке и фракционированию полисахаридов. Для качественного и количественного определения ксилоглюкана в полученных препаратах возможно использовать метод Коймана.
Скрининг грибной коллекции ВКПМ с целью поиска штаммов, гидролизующих КГ, выполнен с использованием классических методов микробиологии и биохимии. Определение активности ферментов, гидролизующих ксилоглюкан, выполняется с использованием динитросалицилового реагента в соответствии с разаработанным методом оценки продуктивности микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз и оценки функциональной активности рекомбинантных ксилоглюканаз.
Создание библиотек клонов и скрининг клонированных грибных ферментов гликозил гидролаз на различных олигосахаридах проведены с использованием классических методов генной инженерии и молекулярной биологии.

Назначение и область применения, эффекты от внедрения результатов проекта:
1. Описание областей применения планируемых результатов (области науки и техники, отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться результат или планируемая на их основе инновационная продукция).
Полученные термостабильные ксилоглюканазы и высокоэффективные штаммы продуценты данных ферментов могут применяться во многих сферах науки и промышленности: в первую очередь в для гидролиза растительного сырья с целью получения сахаров для ферментации с последующим производством продуктов с высокой добавочной стоимостью; новые ксилоглюканазы также могут быть использованы в молекулярной биологии и микробиологии для фундаментальных и прикладных исследований, а также для получения олигосахаридов - ценного сырья для кормовой и пищевой промышленности.
2. Описание практического внедрения планируемых результатов или перспектив их использования.
Использование новых термостабильных ксилоглюканаз позволит осуществить более полный гидролиз растительной биомассы, а также подобрать наиболее эффективные ферментативные композиции для деградации разных видов растительного сырья. Новые ферменты позволят подробнее изучить механизм гидролиза ксилоглюкана, а также определить структурные компоненты исследуемого полисахарида в зависимости от его природного источника.
Помимо этого, новые ферменты в сочетании с другими веществами могут применяться для биополировки текстильных изделий, состоящих из смесовых волокон для более прочной фиксации красящих веществ на тканях, мягкости и т.д.
Кроме того, сочетания в различных пропорциях полученных новых ферментов, как отдельно, так и с уже известными гликозил гидролазами позволит создавать новые, уникальные, сбалансированные корма на основе растительного сырья для животных.
Известно, что некоторые растительные олигосахариды обладают иммуномодулирующими/стимулирующими, пребиотическими, антибиотическими, противовирусными, противоопухолевыми, антипаразитическими, антикоагуляционными, антинейродегернеративными свойствами, а также могут снижать уровень липидов и холестерина. Поэтому, олигосахариды, полученные из комплекса полисахаридов растительной клеточной стенки с помощью новых ксилоглюканаз, найдут применение в пищевой и кормовой отраслях, а также могут быть использованы в медицине, фармацевтике и для производства нутрицевтиков и лекарственных препаратов.
3. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие научно-технических и технологических направлений, разработку новых технических решений; на изменение структуры производства и потребления товаров и услуг в соответствующих секторах рынка и социальной сферы.
Новые термостабильные ферменты, гидролизующие ксилоглюкан, и их высокопродуктивные микробные продуценты расширят существующий арсенал промышленных гликозил гидролаз и создадут базисную платформу для будущих исследований в области гидролиза растительных полисахаридов. Это способствует активному развитию биотехнологической промышленности, разработке новых подходов для получения различных олиго- и моносахаридов и дальнейшему их внедрению в различные сферы производства. Новые микроорганизмы с высокой продуктивностью и специфичностью к ксилоглюканам позволят снизить стоимость ферментов и оптимизировать схему производства тех или иных целевых веществ. За счет того, что полученные ксилоглюканазы сохраняют активность и специфичность длительный период времени при повышенных температурах, что предотвращает заражение ферментационной жидкости посторонней мезофильной микрофлорой.
4. Оценка или прогноз влияния планируемых результатов на развитие исследований в рамках международного сотрудничества, развитие системы демонстрации и популяризации науки, обеспечение развития материально-технической и информационной инфраструктуры.
На сегодняшний день проблема утилизации растительной биомассы актуальна во всем мире. Многие научные группы занимаются поиском и расширением арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов гликозил гидролаз, обладающих высокой специфической активностью и предназначенных для высокоэффективной деструкции природного растительного сырья.
Данный проект проводится в сотрудничестве с Департаментом Микробиологии Технического Университета Мюнхена (Германия).
В рамках данных исследований материально-технические возможности и опыт работы ФГУП ГосНИИгенетика и Департамента микробиологии ТУМ являются взаимодополняющим, что позволяет предполагать успешную кооперацию.
Сотрудники Технического Университета Мюнхена имеют огромный опыт работы в области генетической инженерии бактерий (конструкция экспрессионных векторов и гетерологичная экспрессия ферментов в бактериальных штаммах), подборе сочетания ферментов для оптимизированной деградации полисахаридов, идентификации новых ферментов. В частности, участниками проекта была идентифицирована эндоксилоглюканаза из Clostridium thermocellum, а олигосахариды, полученные из КГ, были охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии. Был проведен скрининг различных бактерий, в том числе бацилл, с целью поиска штаммов, оптимальных для производства секретируемых белков. Были сконструированы вектора для экспрессии в Bacillus, а сами штаммы были оптимизированы путем конструирования мутантов с инактивированной протеазной активностью.
Сотрудники ФГУП ГосНИИгенетика имеют опыт и возможность скрининга микроорганизмов с целью поиска новых ферментов (в том числе гликозил гидролаз). В Государственной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), расположенной на базе института, имеются 606 штаммов грибов, которые могут быть использованы для скрининга. Сотрудники Института имеет опыт работы в области молекулярного клонирования и экспрессии генов в различных микроорганизмах, включая Pichia pastoris; исследования свойств ферментов; получения ксилоглюканов из различных видов растительного сырья; структурного и функционального анализа олигосахаридов.
Взаимовыгодное сотрудничество между российским и немецким институтами основано на обмене результатами и опытом. Преимуществами сотрудничества являются: возможность дополнительного (внебюджетного) финансирования работ по проекту, доступ к современному исследовательскому оборудованию; возможность организации стажировок специалистов. Осуществляется тесная кооперация обоих институтов в процессе идентификации новых ксилоглюканаз, их характеристике и разработке экспрессионных систем для биосинтеза этих ферментов в штаммах Pichia и Bacillus, а также при идентификации олигосахаридов биохимическими и энзиматическими методами.
В результате сотрудничества будут сконструированы рекомбинантных штаммы, продуцирующие ферменты, необходимые для гидролиза ксилоглюкана, в количествах, достаточных для промышленного производства, что может быть основанием для создания стартап-компании по производству рекомбинантных ферментов. В случае конструирования эффективного продуцента в одном из институтов, может быть организовано совместное производство или лицензия.

Текущие результаты проекта:
Гены новых ксилоглюканаз изолированы из геномов термофильных грибных штаммов Sporotrichum thermophile и Myceliophthora thermophila и отсеквенированы, их нуклеотидные последовательности оптимизированы для эффективной экспрессии в Pichia pastoris.
Проведено клонирование синтетических генов ксилоглюканаз в вектор для экспрессии в Pichia. Получены интегративные экспрессионные конструкции, которыми трансформирован штамм Pichia pastoris. Выполнен отбор клонов, содержащих целевые гены.
Проведен скрининг клонированных грибных ферментов из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P. pastoris, на КГ и олигосахаридах, полученных из КГ с помощью эндоксилоглюканаз, предоставленных ТУМ.
Проведена генетическая оптимизация грибных штаммов-продуцентов P. pastoris, содержащих гены рекомбинантных ксилоглюканаз.
Проводятся работы по анализу моно- и олигосахаридов, полученных из КГ путем гидролиза коммерческими и предоставленными ТУМ ксилоглюканазами, а также ферментами тестируемых грибных штаммов.
Начаты работы по полупрепаративному получению олигосахаридов из различных типов ксилоглюканов с помощью рекомбинантных ксилоглюканаз.