Регистрация / Вход
Прислать материал

Биотестирование нанокомпозита Ag/AgCl на примере фитопланктона

Сведения об участнике
ФИО
Тригуб Анатолий Григорьевич
ФИО (на английском языке)
Trigub Anatoly Grigorievich
Название организации
ФГБНУ "ВНИРО"
Тезисы
Название
Биотестирование нанокомпозита Ag/AgCl на примере фитопланктона
Название (на английском языке)
The bioassay of Ag/AgCl nanocomposite on example of phytoplankton
Соавторы (ФИО, организация, город, страна)
Дмитриева Екатерина Сергеевна
Соавторы (на английском языке)
Dmitrieva Ekaterina Sergeevna
Содержание

Существенное увеличение интереса к наночастицам связано с открытием возможности использования наноматериалов во многих областях науки и техники. В мировом сообществе уделяется пристальное внимание к нанотехнологиям и перспективам их использования, а также к разработке методов оценки биобезопасности продуктов нанотехнологий. Практическое применение наноматериалов способно привести к росту технического прогресса и экономики. В то же время, в один ряд с техническим развитием встает проблема изучения и прогнозирования влияния новых материалов на окружающую среду, а также разработка стандартов безопасности. Одним из таких продуктов являются наночастицы серебра, которые могут быть в виде кластеров, коллоидов и нанокомпозитов с различными стабилизаторами. В настоящее время наносеребро одно из часто используемых  наноматериалов в потребительских товарах. Эффекты наночастиц серебра определяются размерами, концентрациями и их стабильностью. Препараты на основе наносеребра и их исследования представляют серьезный научный интерес и направлены против различных антибиотико-резистентных организмов.

Цель работы заключалась в проведении хронических экспериментов на фитопланктоне методом биотестирования, а также обнаружение мест локализации наночастиц Ag/AgCl в клетках водорослей после интоксикации.

Для исследований использовали стандартные тест-объекты – пресноводные зеленые одноклеточные водоросли Scenedesmus quadricauda и морские диатомовые водоросли Phaeodactylum tricornutum. В качестве токсиканта – биоцидный препарат на основе нанокомпозита Ag/AgCl стабилизированный неионогенным ПАВ. Размер частиц 10-70 нм. Продолжительность хронических экспериментов составила 41 сутки в трех повторностях. При проведении экспериментов использовали пресную питательную среду Прата и морскую среду Гольдберга соленостью 200/00 в модификации Кабановой. Освещенность составляла 3000 лк со сменой темнового и светового периода каждые 12 часов при температуре 20±20С. Численность водорослей в контроле и опыте определяли методом измерения быстрой флуоресценции на приборе «Флюорат 02-3М». Детекцию и выявление локализации наночастиц Ag/AgCl в клетках водорослей проводили методом аналитической просвечивающей электронной микроскопии при ускоряющем напряжении 100 кВ на аналитическом просвечивающем микроскопе JEOL -2100 (JEOL, Япония) с энергодисперсионным рентгеновским детектором X-Max (Oxford instruments, Великобритания).

Подготовку клеток водорослей для анализа на аналитическом просвечивающем микроскопе проводили следующим образом: После суток экспозиции водорослей в нанокомпозите Ag/AgCl с концентрацией 2 мг/л, клетки отмывали на чистых средах для культивирования путем центрифугирования при 4000 об/мин. Осадок смешивали с чистой средой, содержащей 2,5% глутарового альдегида и 4% формальдегида, и затем дофиксировали в 1% растворе OsO4 в течение 2 часов. Затем проводили процедуру обезвоживания в спиртовых растворах возрастающей процентной концентрации (30, 40, 50, 60, 70, 80, 96 - каждый этап по 20 минут и 100% - 30 минут). Далее проводили заливку с ацетоном и эпоксидной смолой в пропорциях (1:3, 1:1, 3:1) и чистой смолой. Каждый этап заливки занимал сутки. После чего залитые пробы полимеризовали при 370С в течение суток и далее до полного застывания при 640С. Заполимеризованные эпоксидные блоки нарезали на ультрамикротоме алмазным ножом на срезы толщиной 80-100 нм. Полученные срезы монтировали на медные сеточки для электронной микроскопии с ультратонким слоем из формвара, контрастировали по Рейнольдсу и стабилизировали углеродом.

Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel - 2010, достоверность рассчитывали при помощи критерия Стьюдента с различными дисперсиями, для уровня значимости 0,05.

Для пресноводных водорослей S. quadricauda исследованы 4 концентрации нанокомпозита Ag/AgCl (0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л). В ходе хронического эксперимента установлено, что концентрации 0,5 и 1,0 мг/л на протяжении всего эксперимента ингибировали рост численности клеток относительно контроля. В концентрации 0,1 мг/л в течение 14 суток наблюдался альгостатический эффект, характеризующийся длительным угнетением деления клеток. после 14 суток в концентрации 0,1 мг/л видимо произошла адаптация клеток к ингибирующему действию нанокомпозита Ag/AgCl, и лишь на 25 сутки эксперимента кривая роста клеток водорослей вышла на стационарную фазу. Как правило, в контрольной культуре без воздействия токсикантов кривая роста численности клеток водорослей выходит на стационарную фазу роста на 14 сутки. В концентрации 0,1 мг/л численность клеток достоверно ниже была с 4 по 20 сутки, а на 25 сутки численность достигла контрольного значения и на 30 сутки стала достоверно выше. Это связано с тем, что кривая роста численности клеток, в  контроле достигнув стационарной фазы роста на 14 сутки, снижается. В концентрации 0,05 мг/л альгостатический эффект наблюдался до 7 суток эксперимента, на протяжении 41 суток численность клеток водорослей в данной концентрации была достоверно ниже контроля.

Для морских одноклеточных водорослей P. tricornutum также были исследованы 4 концентрации нанокомпозита Ag/AgCl (0,25; 0,5; 1,0 и 2,0 мг/л). По результатам  эксперимента установлено, что в концентрациях 1,0 и 2,0 мг/л ингибирование роста численности клеток происходило на протяжении всего эксперимента, однако на 30 сутки в концентрации 1,0 мг/л численность клеток начала расти в данной концентрации, что также можно охарактеризовать альгостатическим эффектом. В концентрации 0,5 мг/л на протяжении всего эксперимента численность клеток водорослей была достоверно ниже контроля и лишь на 25 сутки, достигнув стационарной фазы, достигла по численности контроль, после чего численность была достоверно ниже контроля. В концентрации 0,25 мг/л на 14 сутки наблюдалась достоверная стимуляция численности клеток водорослей относительно контроля вплоть до 25 суток, после чего начала снижаться.

По полученным результатам аналитической электронной микроскопии установлено, что наночастицы беспрепятственно попадают в клетки водорослей, как через клеточную стенку, так и через мембрану клетки. Однако не было обнаружено ни путей поступления наночастиц в клетку, ни конкретных мест локализации, где бы они накапливались.

Благодарности
Всем сотрудникам Центра коллективного пользования МГУ им. М.В. Ломоносова Лаборатории электронной микроскопии