Регистрация / Вход
Прислать материал

Сопряженная ферментативная система светящихся бактерий для анализа бактериального загрязнения

Сведения об участнике
ФИО
Кириллова Мария Александровна
ФИО (на английском языке)
Maria A. Kirillova
Название организации
Сибирский федеральный университет
Тезисы
Название
Сопряженная ферментативная система светящихся бактерий для анализа бактериального загрязнения
Название (на английском языке)
Coupled enzyme system of luminous bacteria for analysis of bacterial contamination
Соавторы (ФИО, организация, город, страна)
Есимбекова Елена Николаевна, Сибирский федеральный университет, Красноярск, Россия; Кратасюк Валентина Александровна, Сибирский федеральный университет, Красноярск, Россия
Соавторы (на английском языке)
Elena N. Esimbekova, Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russia; Valentina A. Kratasyuk, Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russia
Содержание

В настоящее время для анализов химических или биологических загрязнений применяются биосенсоры на основе ферментов биолюминесцентных организмов. Так для определения токсических свойств тестируемых веществ используют биосенсор, биомодулем которого выступает ферментативная система светящихся бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза (Red) и люцифераза (Luc) (1,2) [1-2]. Использование выделенных ферментов в качестве тест-объектов позволяет увеличить чувствительность к токсическим веществам и упростить процедуру проведения анализа. Более того, ферментативная система Red + Luc может быть использована для анализа бактериального загрязнения [3].  В этом случае количественный контроль микроорганизмов основан на определении содержания флавинмононуклеотида (FMN) или никотинадениндинуклеотида (NADH) в образце. Действительно,  FMN и NADH являются коферментами во многих метаболических путях и в то же время субстратами сопряженной ферментативной системы светящихся бактерий Red + Luc.

 

FMN + NADH + H+ NADH:FMN-оксидоредуктаза (Red)→   FMNH2 + NAD+                                           (1)

FMNH2 + RCHO + O2  Люцифераза (Luc) → FMN + RCOOH + H2O + свет                                        (2)

 

Целью данной работы было создать новый метод количественного анализа бактериальных клеток в образце, основанный на биолюминесцентной ферментативной системе светящихся бактерий Red + Luc. Были подобраны условия проведения анализа и определена чувствительность анализа к NADH и FMN.

Сопряженная ферментативная система Red + Luc оказалась более чувствительна к NADH, чем к FMN. Пределы обнаружения составили 1,2 нM FMN и 0,1 пM NADH. Линейный отклик системы находился в диапазоне от 0,1 пМ до 1 нМ и от 1,2 нМ до 10 мкМ NADH и FMN соответственно.

В качестве модели бактериального загрязнения были использованы клетки Escherichia coli штамм BL21 codon Plus (DE3) RIPL. Для проведения анализа содержания NADH или FMN  бактериальные клетки первоначально были разрушены ультразвуковым дезинтегратором. Полученную суспензию разбавляли в 2, 3, 4, 5, 8, 10, 16 раз и добавляли в реакционную смесь вместо раствора NADH или FMN, при этом интенсивность свечения биолюминесцентной системы зависела от количества бактериальных клеток в реакционной смеси. Предел чувствительности определяли как количество клеток, при котором интенсивность свечения биферментной системы в присутствии образца в 3 раза превышала интенсивность фонового свечения. Чувствительность биолюминесцентной системы Red + Luc составила 3,9 млн кл/мл и 800 тысяч кл/мл при использовании в качестве маркера FMN и NADH соответственно.

Из литературы известен метод определения бактериального загрязнения с использованием люциферин-люциферазной системы светляков, при этом анализ основан на определении в образце аденозинтрифосфата (АТР). Ранее было показано, что чувствительность мутантной люциферазы светляков к бактериальным клеткам может достигать 1 кл/мл [4-5], что на 6 порядков ниже предела обнаружения бактериальных клеток биолюминесцентной системы Red + Luc, представленной в работе.

Таким образом, следует сказать, что сопряженная ферментативная система светящихся бактерий  Red + Luc может быть использована только для количественного контроля бактериальных клеток в образцах, в которых количество клеток превышает 800 тысяч кл/мл, в других случаях следует использовать люциферин-люциферазную систему светляков.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 16-14-10115.

____________________________________________________________________________________

[1] Esimbekova E, LonshakovaMukina V, Bezrukikh A, Kratasyuk V (2015) Design of Multicomponent Reagents

for Enzymatic Assays Doklady Akademii Nauk 4: 472–475.

[2] Kratasyuk V, Esimbekova E (2015) Applications of luminous bacteria enzymes in toxicology. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 18: 952-959.

[3] Mei C, Wang J, Lin H, Wang J (2008) Quantitative detection of NADH by in vitro bacterial luciferase bioluminescent Acta microbiologica Sinica 49(9):1223-8.

[4] Frundzhyan V, Ugarova N (2007) Bioluminescent assay of total bacterial contamination of drinking water. Luminescence 22: 241-244.

[5] Noda K, Matsuno T, Fujii H, Kogure T, Urata M, Asami Y, Kuroda A (2008) Single bacterial cell detection using a mutant luciferase. Biotechnol Lett 30: 1051–1054.

Благодарности
Не заполнено