Регистрация / Вход
Прислать материал

Оценка токсических эффектов в ряду поколений Daphnia magna как подход биотестирования

Сведения об участнике
ФИО
Олькова Анна Сергеевна
ФИО (на английском языке)
Olkova Anna Sergeevna
Название организации
ФГБОУ ВО "Вятский государственный университет"
Информация о докладе
Вид доклада
Устный доклад
Секция
Методология биодиагностики
Название доклада
Оценка токсических эффектов в ряду поколений Daphnia magna как подход биотестирования
Соавторы доклада (ФИО, организация, город, страна)
Кантор Г.Я., ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, лаборатория биомониторинга, г. Киров
Аннотация
В современном контроле качества природных и техногенных сред биотесты с использованием Daphnia magna Straus являются наиболее распространенными. Используемые тест-функции относятся к морфологическим, физиологическим и биохимическим показателям жизнеспособности рачков. Нами апробирован подход, основанный на оценке состояния трех поколений D. magna, находящихся под воздействием токсиканта. Первое поколение – молодь, полученная от материнской самки за один приплод. Второе и третье поколение формировалось из массовых приплодов, получаемых в ходе эксперимента. Подход апробирован в модельном эксперименте. Тестируемыми средами были природные воды с добавками 2,5 и 5 ПДК хлорида стронция (в расчете на ион). Острого токсического действия для первого поколения выявлено не было. Все эффекты были отсроченными во времени с тенденцией усиления от первого к третьему поколению. Динамика гибели взрослых особей указывает на закономерное ослабление каждого последующего поколения. Пики плодовитости под воздействием токсиканта сдвигаются в первую половину жизненного цикла особей, тогда как в контроле максимум средней плодовитости достигается в период с 25 по 50 день жизни. Плодовитость рачков достоверно снижается с усилением угнетения в каждом последующем поколении. Возрастает количество абортивных яиц и мертвой молоди. Оценка токсических эффектов в ряду поколений D. magna оказалась информативна для исследования возможного отсроченного действия веществ.
Ключевые слова
Биотестирование, Daphnia magna, хроническая токсичность, тест-функция, поколения Daphnia magna
Введение

Представители низших ветвистоусых ракообразных Daphnia magna Straus используются как тест-организмы в токсикологических исследованиях уже свыше 65 лет. Одной из первых публикаций в этом направлении считается классическая работа Э. Науманна «Daphnia magna Straus als Versuchtiere», опубликованная в 1933 г. (Naumann, 1933). Более ранние зарубежные исследования касаются биологии и экологии дафний (Brown, 1929). В России первые работы по применению рачков D. magna в биотестировании принадлежат Н. С. Строганову и его ученикам, а также Л. А. Лесникову (Строганов, 1968; Строганов, Исакова, Колосова 1989; Лесников, 1971).

В настоящее время разработано несколько десятков методик биотестирования, основанных на оценке разнообразных тест-функций D. magna. Среди них можно выделить аттестованные методики, наиболее распространенной из которых является определение токсичности различных объектов анализа по гибели и плодовитости дафний (ФР.1.39.2007.03222…, 2007). В многочисленных научных исследованиях предлагается оценивать как морфологические (Лесников, Мосиенко, 1992), физиологические (Meijering, 1999), так и биохимические параметры жизнеспособности D. magna (Лузгин, 1983).

Относительно короткий жизненный цикл развития D. magna и партеногенетическое размножение рачков дает возможность проводить как пожизненные эксперименты, так и наблюдать за несколькими поколениями дафний, находящихся под исследуемым воздействием. Эффекты биоаккумуляции веществ и отсроченные во времени эффекты до сих пор остаются недостаточно исследованными. Целью работы стала реализация биотеста по ответным реакциям Daphnia magna в трех поколениях для оценки его информативности при исследованиях действия веществ, качества природных и техногенных сред.

Методы и материалы

Объектом представленных исследований служила стандартизированная лабораторная культура Daphnia magna Straus, содержащаяся в климатостате при 12-часом светопериоде с освещением 600 лк, температуре 20±2°С. Модельные эксперименты проводили с использованием молоди D. magna (возраст не более 24 ч.), полученной от синхронизированной по возрасту культуры за счет партеногенетического размножения материнской самки D. magna. Объем тестируемой среды – 100 мл, где содержалось по 10 особей D. magna. Количество параллельных определений в опытах – 4.

Для количественной оценки летальных и сублетальных эффектов и установления их диагностической ценности, проводили биотестирование природной воды питьевого качества, загрязненной соединениями стронция (модельный эксперимент). Эффекты оценивали в трех поколениях D. magna. Первым поколением считаем тех особей, которые были получены от синхронизированной культуры D. magna и помещены в контрольные и опытные пробы. Второе и третье поколение – это молодь от соответствующего предыдущего поколения, полученная уже в ходе эксперимента.

Для постановки эксперимента со вторым и третьим поколением первые немногочисленные приплоды не использовали. Модельные группы F2 и F3 формировали из массовых приплодов в середине жизненного цикла дафний.

Эксперимент проводился в климатостате, смену тестируемых растворов осуществляли на каждые 5-е сутки. Время эксперимента с каждым поколением рачков не стали ограничивать 24 сутками, рекомендованными аттестованной методикой (ФР.1.39.2007.03222, 2007), а продлили до 75 суток, что позволило выявить динамику гибели взрослых особей и их плодовитости.

Модельным токсикантом был выбран хлорид стронция, в котором в качестве токсичного агента выступает ион стронция. Стронций согласно гигиеническому нормативу качества воды водных объектов рыбохозяйственного назначения  относится к веществам II класса опасности, ПДК составляет всего 0,4 мг/дм3 (ГН 2.1.5.1315-03, 2007). Нерадиоактивный стронций является спутником кальция, поэтому загрязнение им природных вод наблюдается близ гипсоносных отложений, доломитов, известняков (Перельман, 1989). Также может выщелачиваться из сырья и отходов химических производств, включаясь в комплексное загрязнение промышленных районов. Негативное влияния стронция на организм человека доказано (Полякова, 2012). Есть сведения о его токсичном действии на растения, в частности блокирование К+-каналов клеток корня (Ивашкина, Соколов, 2006).

Математическую обработку данных проводили с использованием стандартных методов, вычисляя среднее арифметическое (M), его ошибку (m) и стандартное отклонение (S). В табличном виде результат приводим в виде M± S. Достоверность различий сравниваемых значений доказывали с использованием критерия Стьюдента с учетом уровней значимости (p), вычисленных для двух сравниваемых значений. Для расчетов использовали Microsoft Excel.

Полученные результаты

Тестировались растворы хлорида стронция, содержащие 2,5 и 5 ПДК в расчете на ион стронция. Вещество вводилось в артезианскую воду питьевого качества, контролем служила эта же вода без добавок. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Влияние хлорида стронция на смертность и патологические явления у D. magna

Вариант

Поколение

Смертность взрослых особей*, %

Количество абортивных яиц**

Количество мертвой молоди**

25 день

50 день

75 день

Контроль

F1

0

2,5

80,0

0

0

F2

0

5

86,7

2

0

F3

0

3,3

83,5

1

0

2,5 ПДК

F1

12,5

32,5

92,5

39

8

F2

15

62,5

92,5

54

4

F3

25

82,5

90,0

97

9

5 ПДК

F1

10,0

46,7

100

14

8

F2

6,7

46,7

90,0

28

6

F3

16,7

73,3

95,0

37

5

Примечание: * - стандартное отклонение не более 20% от среднего; ** - количество абортивных яиц и мертвой молоди приведено как сумма для четырех параллельных определений.

В кратковременных экспериментах (4 дня) загрязнение воды стронцием на уровне 2,5 и 5 ПДК не оказывало влияния на рачков. Долговременные эксперименты позволили выявить ряд токсических эффектов. Смертность взрослых особей на 25 день во всех опытных вариантах, кроме одного, не выходила за пределы критических 20%, рекомендованных аттестованной методикой как критерий хронической токсичности, но в сравнении с контрольными показателями негативное влияние токсиканта уже проявилось. Тенденция переходит в математически значимую на 50 день опыта. Причем каждое последующее поколение все менее жизнеспособно.

В течение опыта во всех вариантах с воздействием стронция отмечали появление мертвой молоди. Даже невысокие значения этого показателя являются признаком хронического токсического действия тестируемой пробы (Hanazato, 1998).

Известно, что патологические изменения развития партеногенетических яиц могут являться диагностическими признаками негативного влияния на дафний (Sobral et al., 2001). В нашем эксперименте абортивные яйца в контрольных вариантах единичны, тогда как в опытных их количество варьирует от 14 до 97 (в сумме на 4 параллельных определения). Отторгаемых яиц больше при добавке 2,5 ПДК, чем 5 ПДК. Это объясняется тем, что в менее загрязненной пробе к середине опыта оставалось больше живых рачков. Они и обеспечили этот показатель. Мертворожденная молодь также регулярно появлялась при воздействии стронция, в отличие от контроля.

На фоне общего угнетения особей и описанных негативных явлений, плодовитость рачков оказалась достоверно ниже контрольных значений (табл. 2). Приведена плодовитость по 50 день, так как после гибели в эксперименте более 50% особей, расчет на одну самку дает завышенные показатели.

Таблица 2

Влияние хлорида стронция на плодовитость D. magna

Вариант

Поколение

Плодовитость, количество особей на 1 взрослую самку

Плодовитость, % от контрольного значения за 50 суток

1 – 24 сутки

25 – 50 сутки

Контроль

F1

13,4±2,3

15,4±2,9

-

F2

10,2±1,5

15,8±1,3

-

F3

11,3±0,5

14,9±1,8

-

2,5 ПДК

F1

9,4±0,6

7,0±0,4

56,9

F2

7,8±1,1

6,2±0,9

53,8

F3

2,5±0,5

2,6±0,4

19,5

5 ПДК

F1

9,4±0,6

7,2±1,1

57,6

F2

8,4±1,2

7,8±2,0

62,3

F3

2,3±0,5

0

8,8

 

Плодовитость контрольных модельных популяций варьировала от 10,2±1,5 до 13,4±2,3 до 24 дня эксперимента включительно. В следующем оцениваемом периоде наблюдалось постепенное возрастание способности к размножению до 15,8±1,3 особей на 1 взрослую самку, что закономерно связано с наступлением пика жизненного цикла рачков. Достоверных различий в показателях плодовитости контрольных вариантов трех поколений выявлено не было. Это говорит о равномерном развитии каждого следующего поколения и возможности долговременного существования модельных популяций D. magna в созданных условиях.

Плодовитость дафний во всех опытных вариантах оказалась достоверно угнетена по сравнению с соответствующим контролем (p<0,05). При этом в опытных вариантах показатель снижался в поколениях, достигая в третьем поколении варианта 5 ПДК всего около 9% от контрольного показателя (различия достоверны, p=0,03), что свидетельствует о несовместимости исследуемого уровня загрязнения стронцием с жизнеспособностью популяции D. magna. Различия в количестве потомства у первого поколения рачков и второго, находящихся под воздействием стронция, в большинстве случаев не достоверны. Сравнивая фертильность первого и третьего поколения, тенденция снижения плодовитости достигает математически значимого уровня.

Заключение

Таким образом, эксперименты по установлению хронического токсического действия, продленные длительный период всей жизни тест-организма, а также выполненные в нескольких поколениях, являются высоко информативными для подробного исследования действия веществ. Такие опыты позволяют исследовать динамику гибели взрослых особей, продолжительность жизни, в том числе в сериях поколений, количество абортивных яиц, появление недоразвитой и мертвой молоди. Недостатками такого биотестирования является его трудоемкость и длительность по сравнению с другими методами. В силу этого описанный подход не становясь массовым, может найти свое применение в исследованиях, ориентированных на изучение механизмов действия веществ, особенностей их токсикодинамики.

Цитируемая литература
1. ГН 2.1.5.1315-03. Предельно-допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. 2003 (с изменениями на 28 сентября 2007 года)
2. Ивашкина Н.В., Соколов О.А. Блокирование калиевых каналов клеток корня тяжелыми металлами и стронцием // Агрохимия. 2006. № 12. С. 47-53.
3. Лесников Л.А., Мосиенко Т.К. Приемы биоиндикации, биотестирования при текущем надзоре за загрязненностью водных объектов и выявлении превышения их ассимилирующей способности. Методические указания. С.-Пб.: ГосНИОРХ, 1992, 79 с.
4. Лесников Л.А. Методики биологических исследований по водной токсикологии. М.: Наука, 1971.
5. Лузгин В.К. Морфофизиологические изменения дафний при кратковременном воздействии солей тяжелых металлов, их обратимость и влияние на продуктивность популяции: Дисс. … канд. биол. наук.: Л.: ГосНИОРХ, 1983. 203 с.
6. Перельман А.И. Геохимия. М.: Высш. шк.. 1989. 528 с.
7. Полякова Е.В. Стронций в источниках водоснабжения Архангельской области и его влияние на организм человека // Экология человека. 2012. № 2. С. 9-14.
8. Строганов Н.С., Исакова Е.Ф., Колосова Л.В. Метод биотестирования качества вод с использованием дафний // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. 1989. Вып. 1. 78 с.
9. Строганов Н.С. Методика быстрого определения токсичности водной среды // Вестник МГУ. Сер. Биология. 1968. № 3. С. 40-46.
10. ФР.1.39.2007.03222. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний, 2007.
11. Brown I.A. The natural history of Cladocerans in relation to Temperature. Temperature coefficient for development // Amer. Nat.. 1929. № 63, p. 346 – 352.
12. Naumann E. Daphnia magna Straus als Versuchtiere // Kgl. Fysiog. Saliskap, Lund forhunde. 1933. № 2. P. 1-49.
13. Meijering M. P. D. Herzfequenz und Lebensablauf von Daphnia magna Straus. Zs. wiss. Zool, 1999. P. 3-4.
14. Sobral O., Chastinet C., Nogueira A., Soares A., Goncalves F., Ribeiro R. In vitro development of parthenogenetic eggs: a fast ecotoxicity test with Daphnia magna? // Ecotox. Environ. 2001. Saf. 50. P. 174-179.
Благодарности
Выражаю благодарность и восхищение научному руководителю - Тамаре Яковлевне Ашихминой. Благодарю Любовь Владимировну Кондакову за всестороннюю поддержку и помощь.
Название, авторы, резюме (на английском языке)

Evaluation of the toxic effects of a number of generations as an approach Daphnia magna bioassay

Olkova A.S., Kantor G.Ya.

The bioassays using Daphnia magna Straus are most widespread in the modern control of quality of natural and man-made environments. Test functions used in this research are the morphological, physiological and biochemical indicators of the viability of the crustaceans. We tested the method based on an assessment of the status of three generations of D. magna, which were exposed to the influence of toxicant. The first generation - young specimens received from parent females per first litter. The second and third generation were formed of the other mass litters in the course of the experiment. This method was tested in a model experiment. As  testing environments were used  natural water containing additives 2.5 and 5 MPC strontium chloride (based on ion). The acute toxic effects weren't  observed for the first generation. All effects were delayed in time with the trend increasing  from the first to the third generation. The dynamics of death of adult individuals indicates a natural weakening of each successive generation. Peaks of fertility are shifted under the influence of the toxicants to the first half of the life cycle of animals. At the same time in the control the maximum of average fertility is achieved in age between 25 to 50-day of life. The fecundity of copepods was significantly reduced with increased oppression in each successive generation. Number of abortive eggs and dead youth is growing. Assessment of the toxic effects of in several generations D. magna was informative to investigate the possible delayed effect of substances.