Регистрация / Вход
Прислать материал

ЗНАЧЕНИЕ ВОДОПОДГОТОВКИ ДЛЯ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-КУЛЬТУР РАКООБРАЗНЫХ

Сведения об участнике
ФИО
Гершкович Дарья Михайловна
ФИО (на английском языке)
Darya Gershkovich
Название организации
МГУ им. М.В. Ломоносова
Информация о докладе
Вид доклада
Устный доклад
Секция
Биотестирование в нормировании и токсикологическом контроле
Название доклада
ЗНАЧЕНИЕ ВОДОПОДГОТОВКИ ДЛЯ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-КУЛЬТУР РАКООБРАЗНЫХ
Соавторы доклада (ФИО, организация, город, страна)
Мерзеликин Александр Юрьевич, ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», Москва, Россия
Аннотация
На сегодняшний день в нашей стране единой рекомендованной системы подготовки культивационной и лабораторной воды для проведения биотестирования не существует. В работе рассматриваются культивационные среды для ракообразных, рекомендованные отечественными и зарубежными методическими указаниями. Описан опыт использования подготовленной водопроводной (биологизированной) воды и искусственной среды ADaM при проведении токсикологических исследований на ракообразных Ceriodaphnia affinis при пожизненных наблюдениях. Обоснована необходимость проведения дальнейших исследований в направлении создания стандартной синтетической среды для проведения биотестирования с использованием ракообразных.
Ключевые слова
Биотестирование, ракообразные, биологизированная вода, искусственная среда
Введение

Методики биотестирования, целью которых является выявление отдаленных последствий низкоинтенсивных воздействий физических и химических факторов, подразумевают хронические (долгосрочные) наблюдения за продолжительностью жизни и репродукцией тест-объектов, в том числе в ряду поколений. При многократном повторении таких наблюдений в лабораторной культуре ракообразных зачастую проявляется значительная вариабельность исследуемых показателей жизнедеятельности, что может быть вызвано как фенологическими факторами, так и влиянием неконтролируемых условий среды (Гремячих, Томилина, 2010; Filenko et al., 2011). Снижение числа неконтролируемых факторов среды и стандартизация методов биотестирования с использованием гидробионтов является одной из актуальных задач водной токсикологии.

Методы и материалы

К ключевым аспектам стандартизации можно отнести проблему водоподготовки, которая играет большую роль при биотестировании, результаты которого во многом зависят от условий культивирования тест-объектов и проведения экспериментов. Методиками биотестирования рекомендованы культивационные среды для гидробионтов, которые готовятся как путем подготовки воды из природных источников, водопроводной и бутилированной воды (Крайнюкова, 1991; Филенко, Соколова, 1998; Жмур, 2007; ГОСТ Р 56236-2014), так и среды на основе дистиллированной воды с добавлением минеральных солей (Weber, 1991; OECD, 2004; ISO 6341:2012).

Перечисленные методические указания рекомендуют контролировать такие показатели качества культивационной воды, как жесткость, рН, содержание кислорода. Диапазон рекомендуемых значений приведенных показателей довольно широк. Например, согласно OECD (2004) значение рН культивационной воды может лежать в пределах 6-9 единиц, жесткости 140-250 мг/л (по CaCO3). В соответствии с рекомендациями ISO 6341:2012 значение рН культивационной воды может лежать в пределах 7,0-8,3 единиц, жесткости 80-250 мг/л. Таким образом, культивационная вода, удовлетворяющая требованиям принятых методических указаний, может обладать различными гидрохимическими свойствами в зависимости от региона и способа ее подготовки в условиях лаборатории.

При анализе литературных данных отмечено, что большинство зарубежных исследователей используют искусственные среды, рекомендованные методиками US EPA (Weber et al, 1991), OECD и ISO. Комплекты для биотестирования в полевых условиях, такие как DAPHTOXKIT F MAGNA (тест-объект Daphnia magna) используют искусственную среду, рекомендованную ISO, а OSTRACODTOXKIT F (тест-объект бентосная остракода Heterocypris incongruens) - средне жесткую синтетическую воду из методики US EPA. Отечественные исследователи наиболее часто используют подготовленную природную или водопроводную воду (Крайнюкова, 1991; Филенко, Соколова, 1998; Жмур, 2007).

Использование обоих видов культивационных сред имеет как преимущества, так и недостатки. Например, в результате антропогенного воздействия, а также в разные сезоны года состав природной и водопроводной воды изменяется в широких пределах, что может сказываться на сходимости и воспроизводимости результатов хронических опытов. Состав искусственной среды, напротив, практически неизменен. В свою очередь, приготовление искусственных сред требует наличия в лаборатории дистиллированной воды хорошего качества, а также широкого спектра минеральных солей. Среды М4 и М7 (ISO 6341:2012) содержат в своем составе ЭДТА, что исключает возможность исследования с их использованием образцов, содержащих металлы. Кроме того, не все тест-организмы способны расти на описанных в литературе искусственных средах, поэтому помимо синтетических сред описанные методики биотестирования предполагают возможность использования природной и водопроводной воды после ее подготовки.

Помимо культивационной среды выделяют синтетическую среду для приготовления исследуемых растворов при  проведении эксперимента, в состав которой входит 4 минеральные соли: CaCl2*2H2O, MgSO4*7H2O, NaHCO3 и KCl (Weber et al, 1991). При исследовании токсичности проб рекомендуют использовать синтетические среды разной степени жесткости на основе указанной рецептуры, соответствующие жесткости исследуемой пробы. Однако, использование такой среды для культивирования ракообразных и проведения хронических экспериментов предусмотрено только в случае, когда тест-организмы способны поддерживать свою жизнедеятельность на данной среде в течение длительного времени. В других случаях для культивации тест-организмов используют природную или водопроводную воду после ее подготовки, а опыты сопровождают двойным контролем: первым контролем служит культивационная вода, вторым – синтетическая среда, используемая для приготовления растворов.

Таким образом, единой рекомендованной системы подготовки культивационной и лабораторной воды в системе биотестирования на данный момент не существует. Вода, соответствующая требованиям принятых методик биотестирования, может характеризоваться различными гидрохимическими показателями в зависимости от региона и способа ее подготовки в лабораторных условиях.

Полученные результаты

При исследовании продолжительности жизни ветвистоусых ракообразных Ceriodaphnia affinis в лабораторной культуре в качестве культивационной среды применялась биологизированная вода, которая представляет собой подготовленную водопроводную воду (Filenko et al., 2011). Для получения биологизированной воды хлорированную водопроводную воду пропускали через систему фильтров механической очистки. Затем воду отстаивали в течение двух недель в аквариуме при круглосуточной продувке атмосферным воздухом. Отстоявшуюся воду переливали в следующий аквариум с песчаным грунтом, высшей водной растительностью и системой принудительной фильтрации через пористые наполнители. В течение двух недель вода проходила процесс биологизации и аэрации. Под процессом биологизации подразумевается самоочищение воды с участием нитрифицирующих бактерий, а также насыщение ее метаболитами растений. Насыщенную метаболитами высшей водной растительности воду переливали в третий аквариум, где она также аэрировалась. Воду из данного аквариума воду использовали в экспериментах и для культивирования ракообразных по мере необходимости. Перед использованием воду фильтровали через двойной слой мельничного газа №72 для предотвращения попадания в культивационную среду и исследуемые растворы яиц простейших, коловраток и низших ракообразных. При многократном повторении наблюдений за продолжительностью жизни и плодовитостью в лабораторной культуре C. affinis в 2007-2011 гг. проявилась значительная вариабельность исследуемых показателей жизнедеятельности: средняя продолжительность жизни рачков колебалась в пределах от 13,0 до 46,6 суток, максимальная - от 33 до 69 суток (Filenko et al., 2011). Помимо фенологических факторов, нельзя исключать и влияние изменяющегося состава лабораторной воды, приготовленной из водопроводной воды описанным выше способом.

Биологизированная и дехлорированная водопроводная вода использовалась при исследовании эффектов 10-(2’,3’-диметилхинонил-6’)-децилтрифенилфосфоний:бромида («препарат SkQ1») на показатели продолжительности жизни и плодовитости Ceriodaphnia affinis (Гершкович и др., 2013). При проведении данного исследования искусственная среда (М4) не использовалась по причине наличия в ее составе ЭДТА, способного повлиять на активность препарата, исследуемого в исчезающе малых концентрациях. В 5 сериях исследований была использована водопроводная отстоянная вода, приготовленная при принудительной аэрации в течение месяца. В 9 сериях опытов использовалась биологизированная вода. Кроме того, в 11 сериях исследований использовалась смесь описанных вод, приготовленная в пропорции 1:1. В результате исследования был установлен достоверный эффект увеличения средней продолжительности жизни (до двух раз по сравнению с контролем) при постоянном воздействии препарата SkQ1 в концентрации 0,0003 мг/л. Однако величина эффекта препарата при многократном повторении экспериментов была непостоянной. Зависимости продолжительности жизни в контрольной выборке или величины эффекта препарата от типа используемой культивационной воды выявлено не было. При использовании аквариумной и водопроводной воды, а также их смеси эффекты препарата SkQ1 проявлялись в равной степени. Для каждой из использованных культивационных сред можно отметить случаи сниженной, средней и повышенной продолжительности жизни рачков в контрольной выборке.

Среди искусственных сред также известна среда ADaM, созданная специально для пресноводного зоопланктона, где в качестве набора микроэлементов использовали синтетическую морскую соль (Klüttgen, 1994). Среда ADaM показала высокие результаты в «Daphnia Reproduction Test» (репродуктивный тест на Daphnia magna), обеспечивая 100% выживаемости и максимальное число молоди на протяжении 21 дня наравне со средой М4 (Elendt, Bias, 1990).

Среда ADaM была использована для проведения хронических токсикологических исследований, целью которых стало сравнение токсикочувствительности и морфо-функциональных показателей ракообразных Ceriodaphnia affinis на подготовленной водопроводной воде и искусственной среде (Мерзеликин, Гершкович, 2016). В результате проведенных исследований показано, что искусственная среда ADaM пригодна для ведения синхронизированной культуры ракообразных C. affinis в лабораторных условиях. Такие жизненные показатели рачков, как изменение линейных размеров тела, средняя продолжительность жизни и средняя суммарная плодовитость на одну самку при работе на искусственной среде не только не снижаются, но в некоторых случаях значимо повышаются по сравнению с аналогичными показателями, полученными при работе на аквариумной воде. Полученные значения средней продолжительности жизни и плодовитости не выходят за рамки указанных в литературе, что свидетельствует о равной пригодности использованных сред для культивирования C. affinis. Эффекты воздействия бихромата калия в хроническом эксперименте (концентрации 0,01 и 0,03 мг/л) чаще проявлялись при работе на среде ADaM. При проведении острых экспериментов с бихроматом калия полулетальные концентрации за 24 и 48 часов при работе на искусственной среде также были ниже, чем при работе на аквариумной воде, что также свидетельствует о большей чувствительности рачков, либо о более высокой степени биодоступности токсиканта. Таким образом, искусственная среда ADaM может быть применима для нужд биотестирования и других токсикологических исследований с использованием ракообразных. Кроме того, благодаря постоянству состава, она является перспективной для целей стандартизации условий проведения экспериментов. К недостаткам описанной искусственной среды можно отнести использование в ее составе синтетической морской соли неизвестного состава.

Заключение

Вероятное повышение сходимости и воспроизводимости результатов, полученных при работе с искусственными средами, может быть проверено в последующих исследованиях. Поскольку состав культивационной среды может влиять на чувствительность тест-организмов к токсическому воздействию (Мерзеликин, Гершкович, 2016), а также на биодоступность токсических соединений в водной среде, особую актуальность приобретает унификация используемых в биотестировании сред.

Цитируемая литература
1. Гершкович Д.М., Исакова Е.Ф., Филенко О. Ф., Самойлова Т.А., 2013. Повышение жизнестойкости рачков Ceriodaphnia affinis Lilljeborg с применением 10-(2’, 3’-диметилхинонил-6’)–децилтрифенилфосфоний бромида // Вестник Московского Университета. Серия 16: Биология. 2013. №. 2. С. 27–30.
2. ГОСТ Р 56236-2014 Вода. Определение токсичности по выживаемости пресноводных ракообразных Daphnia magna Straus. М.: Стандартинформ. 2015. 40 с.
3. Гремячих В. А., Томилина И. И., 2010. Закономерности накопления соединений ртути планктонными ракообразными Ceriodaphnia affinis // Гидробиологический журнал. 2010. № 4. с. 65–74.
4. Жмур Н.С., 2007. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодафний. (ФР 1.1.39.2007–03–223). 2–е изд., испр. и доп. М.: АКВАРОС, 2007. 56 с.
5. Мерзеликин А.Ю, Гершкович Д.М. 2016. Значение водоподготовки при культивировании Ceriodaphnia affinis Lilljeborg 1900 для целей токсикологических исследований // «Экология родного края»: проблемы и пути их решения. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Книга 1. (28–29 апреля 2016 г.). Киров: ООО «Радуга-ПРЕСС», 2016. 446 с.
6. Крайнюкова А.Н. (ред.), 1991. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118–02–90. М.: Госкомприрода СССР, 1991. 48 с.
7. Филенко О.Ф., Соколова С.А. (ред.), 1998. Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М.: ВНИРО, 1998. 145 с. 32.
8. Elendt B. P., Bias W. R., 1990. Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing. Effects of the optimization of culture conditions on life history parameters of D. magna // Water Research. – 1990. Vol. 24. №. 9. PP. 1157–1167.
9. Filenko O. F., Isakova E. F., Gershkovich D. M., 2011. The lifespan of the cladoceran Ceriodaphnia affinis Lilljeborg in a laboratory culture // Inland water biology. 2011. Т. 4. №. 3. PP. 283–286.
10. ISO 6341:2012. Water Quality Determination of the Inhibition of the Mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Acute Toxicity Test // British Standards Institution, London. 2012.
11. Klüttgen B., Dülmer U., Engels M. and Ratte H.T., 1994. ADaM, an artificial freshwater for the culture of zooplankton // Water research. 1994. Vol. 28. №. 3. PP. 743–746.
12. OECD (Organisation for Economic Co–operation and Development). Test №. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test. OECD Publishing, 2004.
13. Weber C. I. et al. (ed.)., 1991. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms. Environmental Monitoring Systems Laboratory, Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency, 1991. P. 1–275.
Благодарности
Не заполнено
Название, авторы, резюме (на английском языке)

IMPORTANCE OF WATER TREATMENT FOR TOXICOLOGICAL STUDIES USING TEST-CULTURES OF CRUSTACEANS

Gershkovich D.M., Merzelikin A.Yu., Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Today in our country a single recommended system of water treatment for cultivation and laboratory water for bioassay does not exist. The paper discusses the cultivation mediums for crustaceans recommended in russian and foreign guidelines. Described the experience of using prepared tap (bio-) water and the synthetic medium ADaM during toxicological studies on crustacean Ceriodaphnia affinis with lifelong observations. The necessity of further research in the direction of creating a standard synthetic medium for bioassay using crustacean was shown.