Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание биомиметических органоминеральных композитов, воспроизводящих характеристики нативных тканей зубов человека

Общие сведения
Тематическое направление
Науки о жизни
Название доклада
Создание биомиметических органоминеральных композитов, воспроизводящих характеристики нативных тканей зубов человека
Название программы
Российский научный фонд "Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований"
Исполнитель проекта
ФГБОУ ВО "Воронежский государственный университет"/ ФГБОУ ВО "Воронежский государственный университет"
Название проекта
Разработка эффективных методов превентивной стоматологической помощи за счет нормализации обменных процессов в твердых тканях человеческого зуба in vivo с использованием биомиметических материалов, обладающих высоким реминерализационным потенциалом
Номер контракта
16-15-00003
Докладчик (участник)
Участник
Голощапов Дмитрий Леонидович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Основной целью проекта стала разработка биомиметических материалов - модельной среды эмаль/дентинного матрикса твердых тканей человеческих зубов с использованием нанокристаллического гидроксиапатита и ряда основных для человеческого организма аминокислот.
Сопутствующими целями являлись:
-изучение структуры, состава, морфологии и оптических характеристик биомиметических модельных материалов с целью выявления образцов, наиболее полно воспроизводящих свойства эмали и дентина зубов человека по их структурным и спектральным характеристикам.
Исходя из поставленных целей основными задачами проекта являются:
Изучение фундаментальные процессов в биомиметических модельных материалах, имитирующих изменения, происходящие в эмали и дентине зубов человека при развитии кариозного процесса с последующим установлением взаимосвязи этих явлений со структурными и оптическими свойствами твердой ткани зубов человека.
Разработка методов эффективных методов ранней диагностики кариеса твердых тканей человеческих зубов на основе полученных комплексных данных; выявленных закономерностях возникновения и развития кариесогенных заболеваний.
Актуальность и новизна исследования
Ранняя диагностика кариесогенных заболеваний ротовой полости позволяет упредить разрушение зубов, избежать затрат на дорогостоящие материалы используя профилактические средства, улучшить состояние здоровья человека в целом. Трудности раннего диагностирования заболевания кариеса связаны с нанокристаллической природой эмали зубов, её иерархическим устройством, процессах протекающих на наноуровне при утрате части минеральной или органической составляющей эмали. В данном отношении оптические методы диагностирования выделяются как наиболее чувствительные к начальным этапам развития кариеса. Однако проблемой данных методов является определение степени развития поражения, его глубины и выделение сигнала от разного типа затрагиваемых тканей. Степень поражения, затрагивающая различные зоны по глубине зуба: эмаль, дентиноэмалевую границу и дентин, предположительно, может быть определена сканированием и изучением по глубине каждой зоны и выявлением их спектральных особенностей. Известно очень мало работ, затрагивающих спектральный анализ зубов с локальной области. Подобный факт сказывается на невозможности применения оптических методов для прецизионного анализа заболеваний ротовой полости. Проблема диагностирования заболевания кариесогенного характера требует изучения фундаментальных свойств как органической, так и неорганической части зубной ткани человека и, главное, их взаимосвязи. Получив необходимые спектральные характеристики in vitro нативных тканей и модельных материалов, и установив фундаментальные свойства биологических образцов можно осуществлять точную диагностику и упреждать развитие заболеваний кариесогенного характера.
Описание исследования

Оптические и эмиссионные свойства биоматериалов в инфракрасном (ИК), видимом и ультрафиолетовом (УФ) диапазонах тесно связаны с их тонкой структурой, которая определяется внутрирешеточными замещениями, а также молекулярным и локальным атомным окружением.  При этом весомый вклад в оптические спектры нативных твердых тканей зуба вносит как минеральная, так и органическая их составляющая. Добиваясь помимо прочего полного соответствия в особенностях оптических спектров биокомпозитов и нативной твердой ткани зуба человека, можно говорить о точном соответствии их строения и молекулярного состава.

Приготовление образцов биомиметических материалов

Биомиметические композиты, моделирующие органоминеральный состав нативной эмали и дентина, были синтезированы в данной работе с использованием органической и неорганической компонент. Неорганическая составляющая разработанного биокомпозита представляла собой нанокристаллический карбонат-замещенный гидроксиапатит кальция (КГАП). КГАП был получен с использованием  органического источника кальция (яичной скорлупы). Морфологическая организация синтезированного по этой технологии КГАП сходна с морфологией твердых ткани зуба человека и состоит из агломератов частиц со средними размерами ~50 нм. Это является необходимым условием для получения биомиметических образцов, которые способны восполнить естественный биогенный КГАП. Органическая составляющая синтезированного нами биокомпозита представляла смесь полярных аминокислот, обнаруживаемых в эмалевых канальцах зубов. Аргинин, гистидин, лизин и гиалуроновая кислота были смешаны на основе изотонического раствора с нанокристаллическим карбонат-замещенным гидроксиапатитом кальция в пропорции характерной для нативной ткани зуба человека. Данная композиция представляется нам наиболее успешной бондинговой системой для реконструкции и реставрации поврежденных тканей зуба. Следует отметить, что соотношение органической и неорганической компонент в процентном отношении было выбрано как 5/95, 25/75, 40/60, воспроизводя, в некотором приближении, состав эмали и дентина зуба человека.

Подготовка образцов зубной ткани

Для сопоставления характеристик нативных тканей зуба и биомиметических материалов моделирующих их состав в нашей работе были исследованы 10 образцов интактной эмали и 10 образцов интактного дентина. Образцы (срезы) нативных тканей были извлечены из клинически здоровых зубов, которые были удаленны у пациентов в возрасте 18-25 лет по ортодонтическим показаниям.

Срезы были подготовлены следующим образом. Первоначально зубы промывали в проточной воде, механически очищали от зубного налета, далее поверхность зубов высушивали фильтровальной бумагой. После стадии очистки зубы были разделены на специализированной установке - алмазным диском с водяным охлаждением на пластины толщиной до 1 мм. Использовались малые скорости вращения диска для исключения перегрева образца. Полученные шлифы зубов были отполированы с использованием алмазной пасты. Далее шлифы зубов снова промывались и очищались.

Методы исследования

Для анализа молекулярного строения и контроля состава всех исследованных образцов мы привлекли метод ИК-спектроскопии. Спектры были получены с использованием ИК-Фурье спектрометра Vertex-70 (Bruker, Германия) и приставки нарушенного полного внутреннего отражения PLATINUM ATR с алмазной призмой. Спектры были собраны в диапазоне 4000 – 500  см-1.

Сопоставление органоминерального состава и стехиометрии биокомпозитов с нативной тканью зуба человека мы выполнили с привлечением метода фотолюминесцентной спектроскопии. В нашей работе спектры фотолюминесценции были получены при комнатной температуре от поверхности образцов по стандартной методике на основе монохроматора TRIAX550 и охлаждаемого жидким азотом CCD детектора. Лазерный луч был сфокусирован на образце с использованием х10 кратного объектива микроскопа. Рассеянный свет от образца был собран и направлен на монохроматор, после чего детектировался ПЗС матрицей (CCD-детектор). Мощность лазерного излучения составляла ~30 мВт.

Везде в нашей работе при сопоставлении спектров биомиметических материалов со спектрами от нативных тканей зуба мы приводим усредненные спектры твердых тканей зубов.  Это сделано для того, чтобы исключить влияние на полученные экспериментальные результаты пробоподготовки, а также минимизировать появление в спектрах особенностей, обусловленных индивидуальными различиями твердой ткани зуба.

Результаты исследования

Сравнительный анализ ИК-спектров пропускания нативных тканей зуба и биокомпозитов (см. рис. 1) показал, что основные высокоинтенсивные моды колебаний локализованные около 563 см-1, 602 см-1, 875 см-1, 963 см-1, 1022 см-1, 1080 см-1, 1410 см-1, 1450 см-1 относятся к карбонат-замещенному гидроксиапатиту (КГАП) . Небольшой сдвиг полос пропускания в ИК-спектрах биокомпозитов относительно аналогичных мод в спектрах нативных тканей обусловлен, образованием химической связи между органической и неорганической составляющими биокомпозитов, и особенностями строения и дефектами, которые присутствуют в биогенном гидроксиапатите эмали и дентина.

 

Сопоставление ИК-спектров биокомпозитов, интакной эмали и дентина (см. Рис. 1) а также результатов работ [1-3] выявило, что органоминеральный состав разработанных нами биокомпозитов хорошо совпадает с составом, характерным для эмали и дентина зубов человека. Дополнительные полосы, присутствующие в спектрах эмали и дентина в областях 665-800 см-1 и 1400-1600 см-1 , относятся к органической составляющей нативных тканей зубов. Появление этих мод в спектрах биокомпозитов подтверждает предположение, что эти колебания должны быть соотнесены с органической компонентой (аргинином, гистидином, лизином и гиалуроновой кислотой), а изменение их интенсивности согласуется с  соотношением компонент в составе биокомпозита.

По данным люминесценции было установлено, что основные отличия эмиссионных характеристик биокомпозитов от нативных тканей зуба (см. Рис. 2,3) связаны с закладываемым соотношением органической и минеральной компонент. Полоса люминесценции для всех изучаемых образцов находится в области 540 - 620 нм (2 - 2,3) эВ, что соответствует известным литературным данным для эмали и дентина зубов [4,5].

Отсутствие отличий в спектрах люминесценции нативной эмали зуба и  синтезированного нами гидроксиапатита (Рис. 2) мы связываем с тем, что структура и морфологическая организация синтезированного ГАП по полностью соответствует характеристикам эмали зуба как по размерному фактору, так и по типу дефекта в кристаллической решетке, что известно из предыдущих работ [6,7].  Сопоставление спектров биокомпозитов и нативного дентина (см. Рис. 3) показало, что наилучшее совпадение оптических свойств дает соотношение органической и неорганической компонент 40/60.

1.    Kong J., Yu S. Fourier transform infrared spectroscopic analysis of protein secondary structures // Acta Biochim. Biophys. Sin. 2007. Vol. 39, № 8. P. 549–559.

2.    Gremlich H.-U., Yan B. Infrared and Raman Spectroscopy of Biological Materials. CRC Press, 2000. 604 p.

3.      Hedzelek W. et al. Infrared spectroscopic identification of chosen dental materials and natural teeth // Synchrotron Radiat. Nat. Sci. Vol. 6. P. 47.

4.      Jablonski T. et al. Comparative study of the fluorescence intensity of dental composites and human teeth submitted to artificial aging // Gen. Dent. 2014. Vol. 62, № 1. P. 37–41.

5.      Bachmann L. et al. Fluorescence Spectroscopy of Biological Tissues—A Review // Appl. Spectrosc. Rev. 2006. Vol. 41, № 6. P. 575–590.

6.    Goloshchapov D.L. et al. Synthesis of nanocrystalline hydroxyapatite by precipitation using hen’s eggshell // Ceram. Int. 2013. Vol. 39, № 4. P. 4539–4549.

7. Seredin P. et al. Local study of fissure caries by Fourier transform infrared microscopy and X-ray diffraction using synchrotron radiation // J. Synchrotron Radiat. 2013. Vol. 20, № 5. P. 705–710.

Практическая значимость исследования
В ходе выполнения работы нами впервые в мировой практике получены биомиметические композиты на основе карбонат-замещенного гидроксиапатита, синтезированного из биологического источника кальция, и органической составляющей, базирующейся на группе аминокислот, обнаруживаемых в эмалевых канальцах зубов (аргинина, гистидина, лизина и гиалуроновой кислоты).
Синтез биокомпозитов при соотношении органической и неорганической составляющих 5/95, 25/75, 40/60 позволяет смоделировать не только состав, но и оптические характеристики (ИК-спектры и люминесценцию) нативных тканей человеческого зуба (эмали и дентина).
Установлено, что спектр люминесценции интактной эмали зуба практически полностью совпадает со спектром неорганической составляющей разработанного нами биокомпозита, т.е. со спектром нанокристаллического карбонат-замещенного гидроксиапатита, полученного из биогенного источника кальция.
Эксперимент показал, что для полного совпадения оптических спектров разработанного нами биокомпозита и интактной эмали зуба достаточно использования органической составляющей на уровне 5%.
Разработанный нами биокомпозит моделирующий состав дентина, с соотношением органической и неорганической составляющих 40/60 максимально полно воспроизводит особенности спектра люминесценции интактной ткани. Показано, что вклад в полосу люминесценции дентина вносит как органическая, так и неорганическая составляющие.
Обнаруженные нами особенности в спектрах люминесценции интактных тканей и моделирующих их биокомпозитов потенциально значимы для разработки эффективных методов превентивной диагностики уровня деминерализации в твердых тканях зуба человека, возникающей при их кариозном поражении, а также оценки состояния зуба в целом.