Регистрация / Вход
Прислать материал

Исследование влияния нуклеолитических и гликолитических ферментов морских бактерий на пищевые условно-патогенные микроорганизмы

Общие сведения
Тематическое направление
Науки о жизни
Название доклада
Исследование влияния нуклеолитических и гликолитических ферментов морских бактерий на пищевые условно-патогенные микроорганизмы
Название программы
Программа развития ДВФУ на 2010-2019 гг
Исполнитель проекта
Дальневосточный Федеральный Университет
Название проекта
Исследование возможностей использования свойств морских нуклеаз при создании способа комплексной обработки поверхностей мясных продуктов, предотвращающего развитие микрофлоры
Номер контракта
14-08-01-11_и
Докладчик (участник)
Участник
Балабанова Лариса Анатольевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Важной проблемой для мясоперерабатывающей промышленности является поиск новых альтернативных препаратов для антимикробной защиты поверхностей мясопродуктов. Это предусматривает разработку основополагающих принципов биотехнологических подходов улучшения качества и безопасности продуктов питания, производственной среды, разработку и внедрение методов контроля за биобезопасностью продуктов и объектов окружающей среды. Одной из стратегий борьбы с контаминирующими микроорганизмами является использование биологически активных веществ (БАВ) морского генеза для создания технологий производства и системы контроля качества и безопасности колбасных изделий. С этой точки зрения поиск новых ферментов с уникальными специфичностями, которыми являются ферменты морских организмов, является актуальнейшей задачей. Уникальные характеристики ферментов морского происхождения - высокая каталитическая эффективность, психрофильность, необычная специфичность, открывают возможности их использования в качестве барьерных решений в пищевой промышленности при положительной низкой температуре. Исследование возможности применения таких ферментов для разрушения биопленок, получение на их основе универсальных комплексов для обработки колбасных изделий могло бы повысить эффективность борьбы с патогенными микроорганизмами, вызывающими порчу пищевых продуктов. Первоочередной задачей данного исследования было получение функционально активных рекомбинантных аналогов нуклеаз и гликозидаз морского происхождения и изучение их свойств и специфичности по отношению к компонентам микробиального внеклеточного матрикса (биопленки) пищевых штаммов условно-патогенных бактерий.
Актуальность и новизна исследования
В настоящее время в качестве антимикробных препаратов рекомендуется использовать природные консерванты - чеснок, горчицу, хрен, кору дуба, берёзы, растворы уксусной, бензойной, пропионовой кислот, поваренную соль. Однако при использовании этих средств можно добиться лишь слабого торможения развития плесневых грибов. Сорбиновая кислота и ее производные, используемые для замачивания колбасных оболочек, также не обеспечивают необходимого пролонгированного защитного эффекта. Во многих странах для защиты поверхности пищевых продуктов от плесневения применяют препарат «Дельвоцид», имеющий токсико-гигиенические ограничения, поскольку относится к антибиотическим препаратам, которые не рекомендуется применять в пищевой промышленности. Поэтому важной задачей и перспективным направлением является разработка комбинированных антимикробных препаратов нового поколения, направленных на подавление роста бактерий и образования ими биопленок. Известно, что в основе повышенной выживаемости лежат свойства как штаммов микроорганизмов, так и внеклеточного матрикса, включающего в свой состав экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества. Матрикс биопленки может связывать, инактивировать, или не пропускать антибиотики. Кроме того, бактерии в биопленке общаются между собой посредством секреторных интермедиаторов, объединяя усилия против неблагоприятных факторов внешней среды. Одной из стратегий борьбы с биопленками является деградация этого матрикса, или составляющих его компонентов. Неисследованные возможности использования свойств морских ферментов в пищевой индустрии как инструментов для обработки технологических линий и/или продукции представляется перспективным.
Описание исследования

Выделение и идентификация штаммов проводилась из 1 г мясного продукта в условиях аккредитованной лаборатории (ISO/IEC 17025) с использованием микробиологических анализаторов БакТрак 4300 SY-LAB Gerate GmbH (Австрия), МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH на планшете МикроТакс-Е, дополнительные идентификационные тесты ставились по общепринятым методикам. Бактерии р. Salmonella выделялись из 50 г. продукции классическими методами, с предварительным скринингом со среды предобогащения методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе RotorGen 6000 с использованием промышленной тест-системы. Выделение и идентификация штаммов S.aureus проводилась общепринятыми методами с использованием  микробиологического анализатора БакТрак 4300 SY-LAB Gerate GmbH (Австрия). При наличии роста содержимое ячейки высевалась на дифференциально-диагностические среды Байрд-Паркера, солевой агар, желточно-солевой агар, биохимическая активность определялась с помощью автоматизированной системы МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH на планшете МикроТакс-PRO.

Изучение адгезивной и пленкообразующей активности штаммов проводили в стандартных 96-луночных полистироловых планшетах. Бактерии выращивали в среде LB в течение 18-24 ч при температуре 22-37°С. Затем микроорганизмы в дозе 107 мк/мл в количестве 200 мкл вносили в лунки планшета, инкубировали в течение 5-10 суток при температуре 18°С. Среду с клетками удаляли из лунок 0,85% раствором NaCl. В каждую лунку вносили по 200 мкл 0,5% водного раствора кристаллического фиолетового и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. После удаления красителя лунки промывали 3-4 раза дистиллированной водой. Для количественного определения биопленки в каждую лунку планшета добавляли 200 мкл 96% этанола, содержащего 2% уксусной кислоты, и инкубировали при комнатной температуре 15 мин. Наличие и количество биопленки оценивали в планшет-ридере БиоРад (600 нм).

Для определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в исходной культуре (10 ед по стандарту мутности ГИСК им.Л.А.Тарасевича) готовили серию разведений, высевали бактерии в объеме 0,1 мл на дифференциально-диагностическую среду. Инкубировали посевы в течение 1-24 ч при 20-22°С и подсчитывали число выросших колоний.

Все определения проводили в четырехкратной повторности, результаты статистически обрабатывали.

Для исследования действия ферментов морского генеза на условно-патогенные штаммы с наибольшей пленкообразующей активностью были использованы рекомбинантные аналоги альфа-галактозидазы α-PsGal морской бактерии Pseudoalteromonas spp. KMM 701, а также нуклеолитические ферменты морской бактерии Cobetia amphilecti KMM 296.

Рекомбинантные ферменты морских бактерий получали с использованием плазмиды pET40 b(+), экспрессионных геноспецифичных праймеров и геномной ДНК. Для получения чистых препаратов ферментов клетки E. coli центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин, ресуспендировали в 200 мл буфера А (0,02 М NaH2PO4 (для гликозидаз) или Tris-HCL (для нуклеаз), рН 7,8, 0,01% NaN3) и озвучивали на УЗДН 2-Т. Раствор центрифугировали 25 мин при 11000 об/мин, и наносили на уравновешенную буфером А колонку (2,5 × 37 см) с ионнообменой смолой ДEАE-MacroPrep (Bio-Rad). Элюцию проводили линейным градинетом 0-0,25 М NaCl (А). Активные фракции собирали и наносили на колонку (1 × 2 см) с Ni-агарозой (Qiagen). Белок элюировали 200 мМ имидазола (A). Элюат подвергали гельфильтрации на колонке (1,5 × 170 см) с cефакрилом S-200 HR (Sigma), уравновешенной в буфере А. Гомогенность препарата определяли в 12% ДСН-ПААГ.

Для ингибирования образования биопленки ферменты вносили в лунки одновременно с культурой штамма. Инкубировали планшет при 18°С в течение 5-10 суток. Для выявления разрушения биопленки ферменты добавляли в лунки после формирования биопленки при 4-22°С. Дальнейшую обработку лунок планшета и окраску биопленки проводили, как описано выше.

Для электронной сканирующей микроскопии биопленок кусочки агара вместе с покрывающими его бактериями фиксировали в 2,5 % глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М какодиллатном буфере (рН 7,2) в течениу 24 часов.  Затем промывали в том же буфере 24 часа, постфиксировали в 0,5% OsO4, приготовленном на дистиллированной воде 20 минут, промывали пять раз в дистиллированной воде в течениe 5 часов. Затем образцы обезвоживали в серии этанолов и помещали в ацетон. После чего образцы высушивали в критической точке 2 часа, закрепляли на столиках для СЭМ, используя двустороннюю ленту и напыляли хромом толщиной 10-15 нм (Q150 TES, Quorum Technologies). Образцы анализировали с использованием Evo 40 (Carl Zeiss). Разгонное напряжение составляло 29 kV.

Результаты исследования

Было обнаружено, что морская бактерия C. amphilecti KMM 296 в условиях совместного культивирования с другими бактериями существенно подавляет их клеточный рост, а также в разной степени разрушает их внеклеточный полисахаридный матрикс в зависимости от штаммоспецифических свойств. После 96 часов инкубирования зрелых биопленок B. subtilis и P. aeruginosa с метаболитами морской бактерии наблюдалась их полная дисперсия. Известно, что экстраклеточная ДНК играет важную роль в развитии биопленки, обеспечивая структурную стабильность и защиту от антимикробных агентов. Поэтому предположили, что вероятными метаболитами морской бактерии, проявляющими антимикробный эффект, могут быть ДНК-деградирующие ферменты. Для выявления механизма подавления микробного роста и пленкообразования морской бактерией были проверены рекомбинантные аналоги ее нуклеолитических ферментов, таких как щелочная фосфатаза CmAP, а также нуклеазы CmNuc и CmEEP, сконструированные на основе анализа ее полной геномной последовательности (Genbank: JQJA00000000.1). Рекомбинантные нуклеазы CmEEP и CmNUC разрушали до 60 % биопленки при рН 4,6 независимо от вида и штамма в широком диапазоне температур 2-22 ºC. Эффект от щелочной фосфатазы CmAP был строго дозозависимый с максимальным ингибированием роста клеток и новых биопленок, а также разрушением зрелых биопленок при концентрации препарата фермента 1,1-7,6 мкг/мл и активностью 2,5-17,5 ед/мл. 0,1-0,6 единиц фермента CmAP способны разрушить 10-дневную биопленку P. aeruginosa на 71,6±3,2% в течение 1 часа при 18-22ºC. Инкубирование с CmAP при 2-4ºC в течение часа разрушало пленку на 32,8±1,5%. После 3-12 часов инкубации биопленки P. aeruginosa толщина ее была меньше на 78,0±0,7%, чем в контроле. Биопленки штаммов B. subtilis и S. enteritidis при обработке фосфатазой CmAP разрушались на 33,3±1,2 % в течение часа и на 52,8±1,5% через 3 часа независимо от температуры. После 12-часовой обработки ферментом CmAP при 2-4ºC биопленки B. subtilis and S. enteritidis были разрушены на 79,4±5,6%. Биопленка штамма S. aureus была более устойчива к действию CmAP, так как уменьшилась на 42,9%±3.5% только после 3 часов инкубации с ферментом при 18-22ºC, и на 47,0%±0,6 % - через 4 часа при 2-4 ºC. Однако разрушение биопленки на 76,0±1,5% наблюдалось у S. aureus после 12 часов инкубации с CmAP при 2-22ºC.

Результаты электронной микроскопии подтвердили значительное изменение структуры биопленок всех штаммов под влиянием  ферментов морских бактерий. Вероятно, механизм разрыхления биопленок нуклеазами основан на разрушении внеклеточной ДНК. Тогда как дозозависимый эффект щелочной фосфатазы CmAP связан с сигнальной системой межклеточного общения (quorum sensing), приводящий к полному разрушению компонентов матрикса, включая полисахаридные структуры и пили, позволяя клеткам перейти в планктонную фазу жизни.

Так как значительную часть биопленки составляют полисахариды, мы также изучили влияние на нее рекомбинантной α-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 (α-PsGal). Однако в присутствии α-PsGal, вероятно, происходят процессы и гидролиза и трансгликозилирования углеводных структур. Действие фермента на биопленки всех штаммов подтверждает наличие в их структурах галактозидов. Методы ТСХ, ЯМР- и MALDI-TOF-масс-спектрометрии подтвердили образование α-1,6-, α-1,3-, α-1,2-связанных продуктов реакции трансгликозилирования α-PsGal.

 

Практическая значимость исследования
Антимикробная активность щелочной фосфатазы CmAP была использована для обработки свиных сосисок в натуральной оболочке со сроком годности 48 часов. Высокая специфическая активность рекомбинантной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia amphilecti KMM 296 (CmAP) позволяет использовать препараты с низкой концентрацией фермента. Ферментативная обработка препаратом фермента с концентрацией 1,1 мкг/мл и активностью 2,5 ед/мл показала бактериостатический результат в отношении аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (АФАМ), схожий с растворами традиционно применяющихся консервантов - растворов солей лактата и сорбата (5.0 % сорбата калия, 5,0 % лактата натрия, 0,1 % оксид кальция, 5,0 % пищевой глицерин). Однако в отличии от химических реагентов фермент полностью подавил рост дрожжей и плесени на протяжении 96 часов хранения продукта, и лишь через 5-7 дней начали появляться единичные колонии грибов. Рост молочнокислых бактерий не наблюдался в течение 6 дней, по сравнению с 2-ух дневным бактерицидным эффектом после химической обработки продукта.
Свойства морских нуклеаз и гликозидаз значительно разрыхлять биопленки при низких положительных температурах может быть перспективным в использовании комбинированной обработки поверхностей в сочетании с химическими реактивами.
Трансгликозилирующие свойства галактозидазы α-PsGal морской бактерии может быть перспективным для моделирования биопленок бактерий, используемых в биотехнологии и медицине.