Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0001

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0001
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина Российской академии наук
Название доклада
Биоэкономичный синтез лигнанов
Докладчик
Коломыцева Марина Павловна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью работ на 4-м этапе проекта было исследование, подготовка и апробация отдельных базовых компонентов будущей бактериально-клеточной платформы.
Для достижения поставленной цели предполагалось решение следующих задач:
1. Гетерологическая экспрессия в клетках E. coli наиболее перспективных грибных лакказ, активных с природными и неприродными монолигнолами в щелочных условиях.
2. Гетерологическая экспрессия в клетках E. coli наиболее перспективных бактериальных лакказ, активных с природными и неприродными монолигнолами в щелочных условиях.
3. Исследование структурных детерминант лакказ, определяющих их активность при рН>7 и избирательность в отношении природных и неприродных монолигнолов (с использованием методов кристаллизации, рентгеноструктурного анализа и молекулярного моделирования).
4. Создание высокоспецифичных к природным и неприродным монолигнолам алкалофильных мутантных форм лакказ посредством методов направленной эволюции и сайт-направленного мутагенеза.
Актуальность и новизна исследования
Работы 4-го этапа настоящего проекта (2016 г.) призваны разрешить существующие проблемы недостатка информации о структурно-функциональных свойствах наиболее перспективных и ранее отобранных для целей проекта лакказ, способах гетерологической экспрессии их генов в клетках E. coli с целью дальнейшего осуществления ключевой реакции димеризации монолигнолов и получением посредством бактериальной платформы конечных продуктов – лигнанов.
Описание исследования

Применяемые в ходе работ методы: методы выделения геномной ДНК, методы ПЦР, клонирование, секвенирование, методы
гетерологической экспрессии генов, методы регистрации лакказной активности штаммов при погруженном культивировании бактериальных клеток в жидкой минеральной среде (хромогенная реакция и спектрофотометрические измерения), методы кристаллизации белков, методы рентгено-структурного анализа, кинетические методы исследования ферментов, а также методы
статистического анализа полученных данных.

Результаты исследования

В ходе работ по проекту в 2016 году получены следующие основные результаты:

1. Осуществлена гетерологическая экспрессия в клетках E. coli наиболее перспективной грибной лакказы из ранее отобранного грибного штамма Rhyzoctonia solani F-895, активной с природными и неприродными монолигнолами в щелочных условиях.

2. Проведена гетерологическая экспрессия в клетках E. coli наиболее перспективной бактериальныой лакказы из ранее отобранного бактериального штамма Streptomyces violaceus Ac-512, активной с природными и неприродными монолигнолами в щелочных условиях.

3. Осуществлена кристаллизация наиболее перспективных для целей проекта лакказ из ранее отобранных грибных штаммов Lentinus strigosus 1566, Rhyzoctonia solani F-895, Curvularia geniculata F-3561 и Myrothecium verrucaria F-3851. С помощью методов рентгеноструктурного анализа и молекулярного моделирования исследованы структуры лакказ штаммов Lentinus strigosus 1566 и Rhyzoctonia solani F-895, выявлены структурные детерминанты, предположительно определяющие функциональные характеристики ферментов.

4. Получены 5 мутантных форм лакказы грибного штамма Rhyzoctonia solani F-895 с измененными кинетическими свойствами посредством сайт-направленного мутагенеза. Найдены эндогенные детерминанты, определяющие связывание монолигнолов в полости Т1-центра лакказы штамма R. solani F-895.

В настоящий момент осуществляются исследования физико-химических, кинетических и структурных свойств белков-диригентов (atDir6 и fiDir1), адаптация белков-диригентов с целью улучшения их каталитической активности и расширения субстратной специфичности. Проводится оптимизация бактериальной платформы синтеза п-кумарового спирта на основе E. coli для получения  монолигнолов.

Практическая значимость исследования
Полученные в ходе этапа генные конструкции, содержащие гены лакказ, а также их последующие модификации могут найти широкое применение в фармакологической промышленности для синтеза биологически активных соединений и модификации известных соединений с целью получения продуктов с новыми свойствами, детоксикации, деколоризации, деградации ксенобиотиков, для создания сенсоров, чипов и т.д..